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一、呼吸系统疾病模型为何需要实验
呼吸系统疾病是严重威胁人类健康的一大类疾病，而呼吸系统疾病模型的实验对于深入研究此类疾病至关重要。
弥补国内外差距
国家重点研发计划 “呼吸系统慢性疾病实验动物模型研发及应用研究” 的启动意义重大。此项目聚焦呼吸慢病，有望弥补我国与欧美发达国家实验动物模型构建领域的现实差距。随着医学研究的不断发展，实验动物模型在探索疾病机制和制定防治策略方面的作用日益凸显。通过构建更加精准的呼吸系统疾病模型，我们可以深入了解疾病的潜在机制，为制定更加有效的防治新策略夯实理论基础。
临床研究需求
中国工程院王辰院士指出，呼吸系统疾病模型可探索丰富呼吸慢病的潜在机制、制定防治新策略，将实验医学与临床有机结合，发挥动物模型在临床研究探索过程中的先进性和有效性作用。动物模型作为人类疾病的 “缩影”，能够在人为设计的实验条件下反复观察和研究，克服了在人类研究中经常会遇到的理论和社会限制。例如，临床上对外伤、中毒、肿痛等病因研究存在困难，而动物可以作为人类的替难者，在实验室中进行各种疾病和生命现象的研究，进而推用到人类。同时，动物模型可以克服人类某些疾病潜伏期长，病程长和发病率低的缺点，为研究人员提供了更多的研究机会。此外，动物模型可以严格控制实验条件，增强实验材料的可比性，简化实验操作和样品收集，有助于更全面地认识疾病的本质。
二、呼吸系统疾病模型的研究方法
1. 常见动物模型
慢性支气管肺炎模型：常选用大鼠、豚鼠或猴吸入刺激性气体（如二氧化硫、氯、氨水、烟雾等）复制人类慢性气管炎。现发现猪粘膜下腺体与人类相似，且经常发生气管炎及肺炎，故认为是复制人类慢性气管炎较合适的动物。用去甲肾上腺素可以引起与人类相似的气管腺体肥大。
肺气肿模型：
CS 暴露诱发的肺气肿模型：根据临床统计，大约 90% 的 COPD 患者是吸烟者。吸烟是肺气肿的最重要危险因素之一。长期接触 CS 的动物可能导致肺部炎症反应，其主要是由巨噬细胞刺激引起的，肺组织病理表现为支气管腔变窄，支气管软骨组织受损，导致肺泡破裂和（或）融合以及肺气肿的形成，这类似于人类对吸烟产生的反应。CS 暴露诱发的肺气肿可以尽可能模拟人类肺气肿的发病机理，为人类肺气肿的基础和临床研究提供基础。
香烟烟雾提取物（CSE）腹腔注射诱导的肺气肿模型：既往研究者发现在小鼠腹腔内注射 CSE 可产生显著的肺气肿，假设 CSE 可以作为抗原，触发免疫反应引起肺气肿样改变，仅用了 6 周就成功建立肺气肿模型。
弹性蛋白酶诱导的肺气肿模型：气管内滴注弹性蛋白酶破坏了肺组织中蛋白酶－抗蛋白酶之间的平衡，不仅破坏了保护肺组织免受损伤的主要因素，而且还产生了大量的炎症因子，加速了肺泡壁的破裂与融合，从而诱发肺气肿。常用的弹性蛋白酶包括：木瓜蛋白酶、猪胰弹性蛋白酶（PPE）等。
化学物质刺激诱导的肺气肿模型：许多化学物质，包括 NO?、脂多糖（LPS）、氯化铬（CdC12）等都可能引起炎症和肺气肿。
与基因相关诱导的肺气肿模型：随着分子生物学的发展，基因敲除诱导的肺气肿动物模型已被广泛用于肺气肿的研究。
肺水肿模型：
小鼠氯气吸入法致肺水肿模型：取小白鼠一只，25g 左右，称体质量，计数呼吸频率及观察呼吸深度。将鼠放入广口瓶中慢慢通入氯气，待瓶中生成一层薄薄云雾状气体后中止通气。观察动物一般表现及呼吸变化。动物死后即解剖，切开胸腔观察肺组织变化，然后用线结扎气管下端，在结扎的上端剪断气管取出全肺，清除肺周围的其他组织。将肺放在玻璃培养皿内，用纸吸去其外表水分，称取肺的质量，计算肺占体重的百分数，与正常动物对照。
小鼠双光气吸入致肺水肿模型：将 12 mg?L?1 双光气滴在滤纸上，干后放入密闭容器内，将小鼠置于容器内 15min，即可形成肺水肿，全部操作应在通风橱进行数。双光气主要作用于呼吸器官，认为是刺激呼吸道感受器，通过迷走神经将冲动传入四叠体以下中枢，再通过交感神经将冲动传至肺血管，使其通透性增高，而发生肺水肿。
大鼠甲醛吸入法致肺水肿模型：大鼠按随机数字表分对照组（10 只）和甲醛组（14 只）。称量，标记，装入大鼠笼中，置于染毒箱正中，启动加氧泵并盖好箱盖，动物出现明显症状时开始计时，让大鼠在箱内连续吸入甲醛染毒素 2 h，密切观察大鼠的一般反应情况并记录，期间每隔 25~30 min 给箱内喷入雾化甲醛 1 次，每次约 10 mL 。染毒结束后取出大鼠，放室外通风处，禁食不禁水，过 5h 后大鼠颈椎脱臼处死，称体质量及心脏和肺脏湿质量，计算心肺系数、肺指数。
大鼠氯化铵中毒致肺水肿模型：称重实验组大鼠腹腔注射 6% 氯化铵，然后观察一般情况和呼吸，存活时间。对照组不作任何处理，对动物实行安乐死。解剖，先结扎气管以免液体外溢，将肺和心脏一起取出，剪除心脏和其它脂肪组织，用滤纸吸去肺表面的液体，用天平称两肺质量，计算肺质量系数，若肺质量系数＞1%，证明肺水肿已形成。
大鼠肾上腺素静脉输注致肺水肿模型：大鼠称质量后，用 20% 乌拉坦（5 mL?kg?1）腹腔注射麻醉或 1% 戊巴比妥钠 5 mL?kg?1 肌肉注射麻醉，背位固定，做颈部正中纵切口（长 2cm），分离气管、左侧颈总动脉及右侧颈浅静脉。插入气管插管固定，然后将其的一端与压力换能器相连并连接在微机记录系统，描记呼吸曲线。结扎颈浅静脉远心端，在近心端插入静脉插管（内充 0.1% 的肝素化生理盐水）结扎固定，注入 0.5% 肝素（0.01 mL?kg?1）抗凝。结扎颈总动脉远心端，动脉夹夹闭近心端，插入充满 0.1% 肝素的动脉插管结扎固定，将动脉插管经压力换能器连于记录仪或微机系统上，记录一段正常血压曲线。经颈浅静脉推注 0.01% 的肾上腺素（0.1 mL?100 g?1），观察动物的表现及存活时间。动物死亡或处死后，同上取出肺脏，称重并计算肺质量系数。
大鼠油酸静脉注射致肺水肿模型：将试验动物大鼠随机分成 2 组，A 组 8 只，B 组 12 只。A 组为正常对照组，不作任何处理；B 组（试验组）为油酸致伤组，称质量，并沿大鼠尾静脉注射油酸 0.2 mL?kg?1，推注后观察大鼠呼吸频率、湿啰音、咳血、身体抽搐等体征变化出现的时间，并与 A 组进行比较。1.5h 后处死，A 组动物也在同一时间处死。解剖时，先结扎气管以免液体外溢，然后将肺和心脏一起取出，剪除心脏和脂肪组织，并用滤纸吸去肺表面的液体，最后用天平分别称量 A、B 组大鼠的肺质量，计算肺质量系数，若肺质量系数＞1%，证明肺水肿形成。
大鼠氯仿静脉注射致肺水肿模型：有研究者采用大鼠，称重，实验组大鼠腹腔注射 25% 氯仿 12mL?kg?1，然后观察一般情况和呼吸，存活时间。对照组不作任何处理，对动物实行安乐死。解剖，先结扎气管以免液体外溢，将肺和心脏一起取出，剪除心脏和其它脂肪组织，用滤纸吸去肺表面的液体，用天平称两肺质量，计算肺质量系数，若肺质量系数＞1%，证明肺水肿已形成。
家兔快速输液致肺水肿模型：称重家兔 2% 普鲁卡因局部麻醉，将动物仰卧固定于实验台上，分离一侧颈总动脉以备取血，用 BL - 410 生物机能实验系统记录心率及呼吸频率。注入生理盐水（10 mL?kg?1），迷走神经组切断家兔颈部两侧迷走神经。各组动物以出现进行性呼吸困难、发绀、鼻溢出粉红色泡沫样痰，可闻及湿性啰音并逐渐增强为建模成功。
肾上腺素静脉输注致肺水肿模型：沿家兔耳缘静脉注入 1∶5000 肾上腺素 0.4~0.6 mg?kg?1；或在快速输入大量生理盐水后，将 0.1% 肾上腺素 0.5 mg?kg?1 用生理盐水稀释 10 倍后加入输液瓶中，继续滴注，可造成肺水肿。
化学物质性肺水肿动物模型：体重 2kg 以上成年新西兰兔，经腹腔按 30mg/kg 体重的剂量注射戊巴比妥钠麻醉后，仰卧固定头部及四肢于手术台上。颈部脱毛，常规消毒手术区，沿颈正中线切开皮肤，分离气管，作气管插管。经兔耳缘静脉注入 1：5000 肾上腺素 0.4～0.6mg/kg 体重，观察动物的呼吸及一般情况，通过计算机生物信号分析记录系统描记呼吸曲线。当呼吸曲线明显变浅变快时，提示兔已出现肺水肿；此时剖杀动物，计算兔肺 / 体比值 (正常动物肺 / 体比均小于 1g/100g)，一般肺 / 体比均大于 1g/100g (本方法最高可达 3g/100g 以上)。
急性肺水肿模型：急性肺水肿模型通常由左心室后负荷增加引起，如冠脉结扎导致的心肌缺血、缺氧。这会使得心脏收缩功能下降，血液回流受阻，从而引发肺水肿。此模型下，患者可能出现呼吸困难、咳嗽伴有粉红色泡沫样痰、端坐呼吸以及口唇紫绀等典型临床表现。
支气管痉挛、哮喘模型：常选用豚鼠复制急性过敏性支气管痉挛。用生理盐水配成 1∶10 鸡蛋白溶液作致敏抗原，给每只（250g 体重）豚鼠腹腔内注射 0.5ml，致敏注射后 1 周，动物对抗原的敏感性逐渐升高，至 3~4 周时最高。此时再用 1∶3 鸡蛋白 2ml 加弗氏完全佐剂雾化（在雾化室内），致敏动物在此雾室内十几秒钟到数分钟内，就出现不安，呼吸加紧加快，然后逐渐减慢变弱，甚至出现周期性呼吸，直到呼吸停止而死亡。如果动物致敏程度较轻或诱发时鸡蛋白喷雾的浓度很快，则只发生一时性的支气管痉挛，并不死亡。如改用组织胺喷雾，则不必予先致敏，就能引起豚鼠支气管痉挛。组织胺用量依雾室大小而定，在 83~103 容量时，1∶1000 组织胺的用量为 0.5~1ml。狗每周两次暴露于犬弓蛔虫（Toxocaracanis）、猪蛔虫（Ascaris suum）或混合草籽浸出物的气溶胶中可引起实验性哮喘。给用 10??稀释猪蛔虫浸出物皮试阳性狗以猪蛔虫气溶胶吸入，也可引起哮喘。
实验性矽肺模型：常选用大鼠、家兔或狗、猴来复制模型。取一定量含游离 SiO?99% 以上的 DQ - 12 型石英粉，经酸化处理后，选取尖粒 95% 在 5μm 以下的那一段混悬液，烤干后准确称取需用量加生理水制成混悬液（灭菌），大鼠用 50mg/ml，每只气管内注入 1ml；家兔用 120mg/ml，用尘量按 120mg/kg 体重计算，在暴露气管后注入，均可复制成典型的矽肺模型。
2. 评价模型的方法
行为学观察：哮喘发作症状等。
病理学检测：HE 染色、免疫组化、Masson 染色、PAS 染色等。具体来说，HE 染色肺组织学评价可以直观的反应肺损伤的程度，可直观判断肺组织的水肿、出血、炎症细胞浸润、肺泡壁厚度改变及小气道损伤等变化。卵清蛋白诱发的哮喘模型中可通过血清中的 IgE 水平检测、组织学 / ICH 评估、细胞因子和趋化因子检测、蛋白质表达、流式细胞仪检测等方式对治疗哮喘新药进行药效学评估。
三、非侵入式制作呼吸系统疾病动物模型的方法
非侵入式制作呼吸系统疾病动物模型的方法在科研中具有重要意义，能够减少动物的创伤和痛苦，提高实验的准确性和可靠性。以下介绍两种非侵入式方法：
1. 简易小动物肺部气管内雾化给药装置
该装置结合内窥可视喉镜，具有非侵入式、无创伤的特点，大大降低了动物的死亡率。通过该装置进行给药能够精确定量，使药物在各肺叶中分布更均匀，直达肺部。例如北京元森凯德生物技术有限公司研制的简易小动物肺部气管内雾化给药装置，简单迅速，实验重复性好。可输送液体、干粉样品，将精确定量的供试品给到鼠、兔子、犬的肺部。已经在国内外知名科研院所成功应用，为呼吸系统疾病的研究提供了重要的技术手段。
2. 肺部液体定量雾化器
肺部液体定量雾化器是专门为大小鼠、豚鼠等小动物设计的精确进行肺部气管内给药的装置。它能够将定量的液体、粉末供试品雾化给到动物的肺部，具有可定量、较气管内滴入在各肺叶中分布更均匀、更安全的提供高浓度、可输送液体和干粉样品、直达肺部且易于操作等性能特点。广泛应用于呼吸系统疾病、毒理学、药理学、吸入免疫、生物安全、大气污染物、化学物质毒性鉴定、药物开发与安全性评价、环境与健康等领域。相较于传统口服或注射给药，药物直接作用于肺部，无首关消除效应，为呼吸系统疾病的造模和治疗提供了更优的选择。
四、器官芯片在呼吸系统疾病研究中的应用
传统模型的局限性：
二维体外模型通常是在培养皿或孔板上进行单一细胞类型的培养，不能模拟组织器官的固有复杂性。例如，在大多数二维细胞培养模型中，无法复制或模拟细胞与其他类型细胞接触的体内细胞微环境，这会影响细胞的形态、细胞分裂方式、基因表达、细胞分泌和生理功能等。同时，二维培养中细胞极性的丧失也会影响细胞内重要的信号通路。此外，传统的细胞培养方法也不会将细胞暴露于生理机械信号，包括流体剪切应力、应变和压缩等相关的物理刺激，而这些机械因素对细胞增殖、生长和运动以及组织形态发生和器官发育至关重要。动物模型虽然为生命科学研究带来了新思路，但动物研究具有不一致性，经常延误医学进展，致使治疗病人不够及时有效。而且实验室实验程序和饲养动物的环境条件会发生变化，生理过程中存在种间变异以及遗传等因素，导致动物体内环境出现异常，在动物模型中有价值的发现和治疗并不一定适用于人类。
器官芯片的定义及发展前景：
器官芯片中的微流控芯片利用微工程技术在三维系统中培养细胞，包括培养类器官。类器官是器官特异性的多细胞 3D 培养，概括了相应器官的一些关键结构和功能特性。器官芯片是一种用于细胞培养的微流体装置，由连续灌注的腔室组成，腔室由活细胞组成，以再现组织的生理功能。在肺类器官方面，广泛的研究已经从各种来源开发了肺类器官，包括人类多能干细胞、原代呼吸细胞和旨在模拟肺的细胞系发育、再生和疾病等。肺器官芯片细胞培养装置可复制和模拟人肺的 3D 微体系结构和微环境、呼吸运动以及人肺的主要生理功能，具有广泛的应用前景，已经显示出研究人类的生理和疾病病因的潜力。
器官芯片技术：
（1）基于光刻的微加工技术：研究人员使用 lithog-raphy-based 微制造技术设计了一种聚合物聚二甲基硅氧烷肺芯片模型。该模型由上下微通道组成，由一层薄薄的（10μm）柔性微孔胞外基质包被膜隔开。在纤维连接蛋白或胶原蛋白包被的多孔膜上，上半部由培养的人肺泡上皮细胞组成，下半部由培养的人肺毛细血管内皮细胞组成。当肺泡细胞融合，将上通道的介质吸出，与肺泡细胞形成一个气液界面，下通道维持培养基连续流动。柔性 PDMS 侧壁有规律的机械拉伸和中央多孔膜与粘附的细胞层拉伸，模仿了生理呼吸运动。使用相同的技术，其他研究人员设计了另一个包含上皮细胞气道的微流控肺模型，将细胞分别培养在气液界面、肺成纤维细胞和微血管内皮细胞三个垂直堆叠的腔室中，每个腔室由纳米孔膜隔开。
（2）热塑性塑料技术：器官芯片领域相关研究人员开发了一种肺芯片上气道的热塑性芯片。芯片复制模拟了肺气道微环境中光滑肌肉细胞、上皮细胞和支持 ECM（胶原、基质或两者结合）之间的相互作用。该芯片含有气液界面培养的上皮细胞，悬浮水凝胶层代替了培养 SMCs 的膜和介质物。该装置可拆卸提取悬浮水凝胶进行进一步分析，可用于研究 SMC、EC 和细胞基质在慢性肺部疾病发展中的相互作用。
