Tel：13770851495
一、微透析技术概述
微透析技术是从上世纪八十年代发展起来的一种微量生物化学采样、检测技术。它将灌流取样和透析技术相结合，具有活体取样、动态观察、定量分析等优点，被广泛应用于基础医学研究领域。
微透析技术的主要原理是以透析原理为基础，通过对插入生物体内的微透析探头在非平衡条件下进行灌流，物质沿浓度梯度逆向扩散，使被分析物质穿过膜扩散进入透析管内，并被透析管内连续流动的灌流液不断带出，从而达到活体组织取样的目的。
微透析系统装置主要由微量泵、微透析探头、收集器、连接管及配套设备组成。微量泵以注射泵为佳，流速一般为 1~5μl/min。微透析探头有多种类型，包括直线性探头、环形探头、同心型探头等，实际应用需根据具体组织和待测物选择不同的探头。目前普遍应用的是同心型探头，通常由一管式半透膜与不锈钢、石英或塑料毛细管构成双层管道，长度一般为 1～10cm。半透膜由再生纤维素、聚碳酸酯或聚丙烯腈制成，载留分子量 5～10KD 不等。
微透析技术最大的优点是可在基本上不干扰体内正常生命过程的情况下进行在体、实时和在线取样，特别适用于研究生命过程的动态变化。其优点还包括活体取样、动态观察、定量分析、采样量小、组织损伤轻等。此外，样品的采集与分析过程既可在位又可离位进行，还可以单独取得细胞外液，对体内神经递质的释放量进行动态监测，具有重要的生物学意义。
然而，微透析技术也存在一些缺点，主要是对取出的样品进行准确可靠的校正较为困难，这涉及到对探针的回收率的测定。探针回收率取决于取样部位的生物学性质、透析膜的物理性质、待测物质的分子量、灌流速度、压力、生物体本身的健康条件和生物节律等因素。目前测定回收率的方法主要有外标法、内标法和反透析法，但这些方法都存在一定的局限性。
二、微透析技术在动物实验外包中的常见问题
（一）探针问题
探针的选择与规格：
不同实验需求下，探针的选择至关重要。微透析探针的供应商有瑞典的 CMA 公司，美国的 BAS 公司和日本的 EICOM 公司，也有实验室采用自制的微透析探针。选择探针时需考虑定位脑区的深度和所需检测的目标神经递质的分子量大小。例如，EICOM 公司的脑组织探针主要有三个系列，可根据具体情况选择合适的规格。一般来说，探针的规格包括膜长、截留分子量等参数。如管长 4mm，膜长 2mm，膜材料为人造纤维素，50kDa 截留分子量的探针适用于特定的实验需求。
此外，探针的选择还需考虑植入区域的软硬度、体积大小等因素。如植入脑部、血液时常选用同心圆探针、皮肤选择线性探针。根据分子的性质选择合适膜材、分子截留量的探针也很重要，一般情况下选择膜长的探针类型可考虑分析的带电性、分子量和立体结构等因素。
探针的损坏与维护：
在动物实验外包中，操作过程中易损坏探针，因此延长探针寿命和使用次数至关重要。操作探针需要细心，避免探针膜的损坏。探针使用前的处理以及在使用间隔时候的处理、冲洗、浸泡等操作，目的也是延长探针的寿命和使用次数。
在进行探针检测时，用管路接头和管路连接探针的入口与注射器针头（长进短出，黄进蓝出）；以低速（1L/min）向探针注射三蒸水，若整个探针膜表面有湿润或 “流泪” 现象出现，则该探针正常，可以使用；若观察到探针膜某处成股状流出三蒸水，说明探针膜有破损或漏洞，应更换探针。
（二）取样问题
平衡时间的确定：
开始取样后，平衡时间的选择对实验结果有重要影响。在清醒大鼠取样中，由于插入探针时的刺激、微透析液中混有破碎细胞的细胞内成分等都会对检测结果造成一定的影响，所以开始取样后 60min（平衡时间）透析液弃去不用，待目标神经递质检测结果达到稳定，便可定时收集样本至 -80℃保存。
取样速度的控制：
取样速度与平衡时间成反比，在实验中需要协调两者以获得准确结果。当速度过快时，平衡时间长，透析液中神经递质含量过低。在清醒大鼠取样中，用复方氯化钠以 2μL/min 的速度收集样品，需要根据实际情况选择合适的取样速度和平衡时间。
（三）实验动物问题
动物的适应性：
放入清醒系统笼子内的动物需要适应时间，以减少新异刺激对实验的影响。在取样前应先将大鼠放入装置适应 15min，这样可以让动物更好地适应环境，减少环境因素对实验结果的干扰。
动物的生理状态：
传统血液采集方法对动物的损害较大，而微透析技术具有对组织损伤小、取样少、方便、快捷、可连续监测且易实现自动化等优点，能减少对动物的影响。通过微透析技术，可以在基本不干扰体内正常生命过程的情况下进行在体、实时和在线取样，更接近于动物的正常生理状态。
三、解决方法与建议
（一）技术改进
大分子微透析：采用更大截留分子量的膜，允许蛋白质、肽类等大分子穿过，同时解决组织水肿问题。目前，Eicom 推出了大分子透析探针 AtmosLM?，其膜为 1,000,000 Da MWCO（截留分子量），允许大分子通过。探针内的排气口防止探头内的压力超过大气压，防止流体在膜处泄漏。越来越多的蛋白质被成功地检测出来，包括 TNF-a、淀粉样蛋白 b、IL-6、Tau、BDNF 和 CRF 等。此外，在灌注液中加入抗体或其他亲和剂可以增加浓度差和回收率，使神经肽和细胞因子的收集率提高几倍。
高时间分辨率：结合高灵敏度分析方法，如毛细管电泳和激光诱导荧光检测，提高时间分辨率。高灵敏度的方法可以测定每隔几秒收集的馏分，显著提高了使用高效液相（HPLC）进行分析的时间分辨率。毛细管电泳（CE）分离的高速度也使其与通过以秒间隔收集的大量馏分相兼容。通过由不混溶流体（氟化油）分割透析探针流出的液体，使用微流体 T 形进行分割，安装在动物的头部上以产生纳升体积分数收集器，分段样品不会通过流动或扩散混合，无论所需的连接管长度如何，都可以将时间信息保持几秒钟，极大地提高了微透析的时间分辨率，可与高时间分辨率的光遗传、电生理等技术手段更有效结合。
高空间分辨率：制造更小的探针或采用低流速推拉灌注，提高空间分辨率。可以制造更小的探针，例如长 0.5 毫米，直径 200 微米，如果使用的分析方法足够灵敏，可以成功使用。更激进的方法是使用低流速推拉灌注，突破传统微透析探针直径通常为 200 至 400μm，采样长度为 1 - 4mm 的限制，增加从较小的大脑区域采样的可能性。
（二）操作规范
准确埋置探针：确保部位和深度准确，选择合适的膜长度，以获得最多的微透析样品。在进行动物微透析实验时，埋置探针的部位要准确，埋置探针的深度也要准确，选择探针的膜长度需要合适。例如，使用立体定位仪，把探针底座埋入在头盖骨上面选定的位置，在孔洞附近打 2 - 3 个孔安装螺丝增加探针底座与头盖骨的粘合力，用粘合剂固定探针底座后，再插入探针。重要的是需要精确选准探针埋置的部位，才能够得到最多的微透析样品。
细心操作探针：避免探针膜损坏，延长探针寿命。操作探针需要细心，避免探针膜的损坏，从而延长探针的寿命和使用次数。在连接注射器、探针、液体选择开关、自动恒温冷冻收集仪等系统时，需要细心操作，防止漏液和堵塞，也要防止连接管和接头的损坏。探针、连接管、接头是消耗品，细心、正确的操作方法能够延长其使用寿命。
探针处理：使用前和使用间隔的处理，冲洗、浸泡等，延长探针寿命和使用次数。探针使用前的处理以及在使用间隔时候的处理，如冲洗、浸泡等操作，目的也是延长探针的寿命和使用次数。以瑞沃德的微透析探针为例，将大鼠麻醉后备皮，固定于脑立体定位仪，用碘伏对手术部位进行消毒，切开头部皮肤，分离脑膜，撑开颅骨两侧皮肤，曝露颅骨，擦洗颅骨后确定前囟坐标，打孔并插入微透析套管，用牙托粉和牙托水混合固定微透析套管，恢复 1 - 2 天可进行微透析。在实验过程中，注意操作探针的细节，延长其使用寿命。
四、总结
微透析技术在动物实验外包中虽然存在一些难题，但通过技术改进和规范操作，可以充分发挥其优势，为基础医学研究提供更准确、可靠的实验数据。
微透析技术作为一种微量生物化学采样、检测技术，在动物实验外包中具有重要的应用价值。然而，在实际应用过程中，也面临着探针问题、取样问题和实验动物问题等挑战。
为了解决这些问题，可以采取技术改进和操作规范等措施。在技术改进方面，大分子微透析、高时间分辨率和高空间分辨率等技术的应用，可以提高微透析技术的性能和适用性。在操作规范方面，准确埋置探针、细心操作探针和探针处理等措施，可以延长探针的寿命和使用次数，提高实验的准确性和可靠性。
总之，微透析技术在动物实验外包中具有广阔的应用前景。通过不断地技术改进和规范操作，可以充分发挥其优势，为基础医学研究提供更准确、可靠的实验数据。
