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一、肝癌动物模型的重要性
肝癌动物实验模型在肝癌研究中起着至关重要的作用。它为深入研究肝癌的发病机制以及进行药物筛选奠定了坚实的基础。
目前，手术切除及肝脏移植是肝癌治疗的首要选择，然而肝癌发病隐匿，进展迅速，大多数患者确诊时已失去手术最佳时机，病死率居高不下。因此，建立良好的肝癌动物模型成为人类医学研究的关键。
动物模型可以帮助我们深入研究肝癌发生发展的分子机制，探索肝癌发生的遗传学、环境学和免疫学因素。例如，H22 小鼠肝癌细胞是一种常用的实验室模型，经过多年的连续传代培养已成为具有相对稳定性和易扩增性的肝癌细胞系，被广泛应用于肝癌相关的研究中。该细胞系具有快速增殖、易扩增、强大的侵袭和转移能力等特点，可用于模拟肝癌的发生、发展和转移过程，探索肝癌病理生理特点和分子机制，以及筛选和评价肝癌治疗药物和新型治疗方法。
此外，不同的动物模型在肝癌研究中也各有其独特的价值。比如，小鼠与人类在基因水平上高度同源，实验成本低、生存率高、饲养方便，可形成各种实验用近交系，遗传性状稳定，利于实验重复。常用的造模方法有诱发型、移植型、转基因型等。大鼠的基因序列、全基因组与人类相似，抗病力强，对外界环境适应力强，存活率高，其肝脏再生能力强，适合肝脏相关疾病的研究，多选用诱发型造模方法。兔是少有的大型肝癌动物模型，模型成型快，造模方法简单易操作，肿瘤类型与人类巨块型肝癌类似，但易发生转移和扩散。树鼩在生物学特性方面与人类有很高的相似性，对肝炎病毒有易感性，可为研究 HBV 与肝癌发病的关系提供实验模型。土拨鼠在 HBV 研究中应用广泛，其肝炎病毒与 HBV 核苷酸同源性高，免疫反应类型和强度与人感染 HBV 高度相似。斑马鱼与人类基因高度同源，生长发育迅速，易于大规模饲养，透明性胚胎便于观察肿瘤进展，多采用转基因技术构建肝癌模型。
总之，肝癌动物模型在肝癌研究中具有不可替代的重要性，为肝癌的基础理论和临床应用研究提供了有力的支持。
二、常见的肝癌动物模型
（一）小鼠模型
小鼠作为肝癌模型具有诸多优点。首先，实验成本低，适合大规模的实验研究。其次，小鼠生存率高，饲养方便，可在多种环境下生存。此外，小鼠可以形成各种实验用近交系，遗传性状稳定，利于实验重复。常选用诱发型、移植型、转基因型的造模方法对 BALB/c 小鼠、C57BL/6 小鼠、KM 小鼠进行造模。裸鼠是由 BALB/c 近交系小鼠基因突变而来，主要特点是没有胸腺，不排斥异种动物的组织，多用移植型造模方法进行造模。
（二）大鼠模型
大鼠模型也有其独特之处。大鼠的基因序列、全基因组与人类相似，抗病力强，对外界环境适应力强，存活率高。动物器官、组织也较小鼠大，方便后期实验标本的观察与统计。体型适中，可以提供足够的实验分析所需要的血液、体液样本，易于实验操作。另外，大鼠肝脏再生能力强，切除 60%~70% 的肝叶仍有再生能力，适合肝脏相关疾病的研究。由于大鼠自发型肿瘤的发生率低，多选用诱发型的造模方法，如二乙基亚硝胺（DEN）联合 CCl4 对 SD 大鼠、Wistar 大鼠、F344 大鼠等进行肝癌造模。
（三）兔模型
兔是少有的大型肝癌动物模型。其优势主要体现在以下几个方面：首先，模型成型快，造模方法简单易操作。通过移植接种 VX2 瘤株，可诱导肝癌的发生。其次，造模成功后的肿瘤类型和人类巨块型肝癌肿瘤类似，可较好地还原人类巨块型肝癌发病过程。再者，造模周期短，价格低廉，模型存活率高。最后，兔体型大，可接种的部位广泛，肝、肾脏等部位都可以接种。然而，兔 VX2 肝癌模型易发生转移和扩散，对单纯研究 PHC 存在一定的影响。
（四）树鼩模型
树鼩在肝癌研究中具有独特优势。在生物学特性方面，树鼩与人类有很高的相似性。选用树鼩作为 PHC 模型的优点有：其一，对肝炎病毒有易感性，可以模拟人类感染 HBV 后发展至肝癌的发病过程，为研究 HBV 与肝癌发病的关系提供了一个很好的实验模型。其二，进化水平高，新陈代谢和机体解剖比鼠类动物更接近与人。但树鼩产仔少、胆小、易受惊吓，在一定程度上影响其推广。目前造模常用的树鼩品系为树鼩瑶山亚种（Tupaia belangeri tonquinia）、树鼩滇西亚种（Tupaia belangeri chinensis）。
（五）土拨鼠模型
土拨鼠在 HBV 研究中应用广泛。选用土拨鼠作为 PHC 模型的优点为：首先，土拨鼠肝炎病毒（WHV）与 HBV 的核苷酸同源性达到 60% 以上。其次，土拨鼠感染 WHV 后的免疫反应类型和强度也与人感染 HBV 高度相似。最后，土拨鼠寿命可达 10 年之久，在制备慢性 HBV 感染的动物模型中具有独特优势。虽然没有肝硬化和腹水的阶段，但对模拟病毒感染、肝癌的后续发展以及对病毒和肿瘤的免疫反应都有极高的研究价值，多用于抗病毒药物的筛选、免疫学研究等。
（六）斑马鱼模型
斑马鱼作为肝癌模型有以下特点：首先，与人类基因高度同源。其次，肝细胞的组成、功能等与人类相似。再者，生长发育迅速，产卵快，易于大规模饲养。最后，透明性胚胎，易于观察肿瘤进展。目前多采用转基因技术对斑马鱼进行肝癌模型的构建，如 xmrk/kras 或 myc 基因突变的转基因斑马鱼模型等，多用于候选基因与药物靶标的筛选工作。
三、常用动物模型的建模方案
（一）自发型肝癌模型
简述：自发型肝癌模型是指模型动物在人工创造的环境条件下，没有经过人工处置而自发性发作的肿瘤。这种模型最大的优点就是排除了人为因素的干扰，较好还原了动物模型在自然条件下的发病情况。自发型肝癌模型的发病时间与动物品系、性别、饲养方式等因素有关，目前主要用来反映动物的肿瘤易感性、致癌物质和环境因素对肝癌的影响。不过因此类模型的肿瘤发生率低，即使发生肝癌，肿瘤（大小、数目和部位等）和模型动物（性别、体质量和肿瘤发生时间等）都存在很大差异，在临床病理研究与抗药研究中数据不可控，离散度较大，所以自发型肝癌模型在现代的动物造模中较少使用。
（二）诱发型肝癌动物模型
简述：诱发型肝癌模型是指使用诱癌因素在实验条件下诱使动物发生肿瘤的动物模型。由于这类模型的诱发因素和条件是人为可控的，诱发肿瘤的成功率也远远高于自然发病率，所以是建模的常用手段之一。诱发型肝癌模型有建模周期长、成本低、造模成功率高的特点，常用小鼠、大鼠和树鼩作为造模对象，能够能准确反映癌症生物特性和行为，充分模拟人类肿瘤生长微环境，是现阶段常用的肝癌动物模型。
1.DEN 诱导
简述：DEN 是目前常用的诱癌剂，其主要原理是 DEN 对肝脏有特定的毒性，使肝细胞大面积坏死，最终诱导原发性肝癌的发生。DEN 作为诱癌剂具有以下特点：
操作方便，多采用注射器腹腔注射的形式给药。例如用 C57BL/6 雄性小鼠 [6~10 周，(22±2) g]，每周 0.014% DEN 灌胃 6 天，第 7 天正常饮水间隔 1 天，持续 15 周，第 16 周检测小鼠全部造模成功。
诱癌成功率高，小剂量、多次给药便可诱发肝癌。如取体重 250g 左右的封闭群大鼠，喂养普通饲料，随意饮水，给与 0.25% 的 DEN 水溶液 0.25~1mL 灌胃或稀释 10 倍放在饮水瓶中自由饮水，剂量为每天 2~10ml/kg 喂养半年以上，大鼠致癌率可达 70%。
对啮齿类动物诱导肝脏病变具有稳定性，可模拟肝损伤 - 肝炎 - 肝硬化 - 肝癌的发生过程。采用 DEN 的传统诱癌实验均连续给药，易导致肝功能进行性不可逆性损伤，而在诱癌 4 周后，停饮含 DEN 水而改饮灭菌自来水 4 周，使大鼠肝细胞损伤修复和代偿增生，在损伤修复中损伤 DNA 误配修复和微卫星不稳定导致基因突变加剧，继而在 DEN 诱癌过程中加速癌变，减少肝功能损伤而促进肝硬化及癌变。该试验至第 18 周末，诱癌成功率达 100%。造模过程中以低浓度 DEN 通过自然饮水，诱发的大鼠肝癌接近自然过程，而且采用单一致癌剂，免受其他致癌因子的影响，有利于对病变的观察和分析。
四、其他构建方法
（一）条件性敲除小鼠实验
条件性敲除小鼠是指在特定组织或细胞中敲除目的基因的小鼠模型，其实现主要通过染色体位点特异性重组酶系统，如 Cre-loxP、Flp-FRT、Dre-Rox 等，其中最常用的是 Cre-loxP 系统。
条件性敲除小鼠的定义：条件性基因敲除小鼠（也叫 Flox 小鼠）是指在目的基因中含有成对的 loxp 位点的小鼠，与 Cre 工具小鼠交配后可在特定的组织或细胞中敲除目的基因。
实现方法：通过 DNA 同源重组方法，在拟敲除基因片段的两侧分别放置一个同向的 loxP 位点，得到 Floxed 小鼠。将 Floxed 小鼠与组织或细胞特异性表达 Cre 重组酶的小鼠交配，Cre 重组酶可识别 loxP 序列，根据 loxP 的方向性，将两个 loxP 序列之间的 DNA 片段切出并环化或导致序列发生反转，从而实现目的基因在特定组织或细胞中的敲除。
敲除对象：条件性基因敲除的靶基因中必须带有可以被 Cre 重组酶识别的 loxP 序列，这种基因称为 floxed gene。带有 floxed 靶基因的小鼠称为 flox 小鼠。
发生时机：Cre 工具鼠中，将 Cre 重组酶的编码序列置于特定的基因启动子下，Cre 的表达特性决定了靶基因何时何地发生敲除。Cre 在哪一种组织细胞中表达，靶基因的敲除就发生在哪种组织细胞；Cre 的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率；使用诱导型 Cre 重组酶可以通过给予诱导剂，决定在特定的发育时期或疾病发生阶段，定时地进行基因敲除。
交配策略：
将获得的 flox 杂合子小鼠（geneflox/+）分成两部分。一部分 flox/+ 小鼠与 Cre 小鼠交配，同时获得 flox 阳性且 Cre 阳性小鼠（geneflox/+；Cre+），flox 阳性且 Cre 阴性小鼠（geneflox/+）；另一部分 flox 小鼠自交，获得 flox 纯合（geneflox/flox）和 flox 杂合小鼠（geneflox/+）。
为获得 flox 纯合且 Cre 阳性的小鼠，可有两种繁育方法选择。一种是将获得的 flox 和 Cre 双阳性杂合子小鼠（geneflox/+：Cre+）与 flox 杂合子小鼠（geneflox/+）交配，最终获得 flox 纯合且 Cre 阳性的实验组小鼠（geneflox/flox；Cre+）和 flox 纯合且 Cre 阴性的对照组小鼠（geneflox/flox）；另一种是将获得的 flox 和 Cre 双阳性杂合子小鼠（geneflox/+：Cre+）与 flox 纯合子小鼠（geneflox/flox）交配，最终获得 flox 纯合且 Cre 阳性的实验组小鼠（geneflox/flox；Cre+）和 flox 纯合且 Cre 阴性的对照组小鼠（geneflox/flox）。
为快速获得所需小鼠，可将 geneflox/flox；Cre + 小鼠与 geneflox/flox 小鼠杂交。
基因型鉴定方法：
小鼠编号原则。
Flox 小鼠基因型鉴定（用于鉴定 flox 纯合、杂合和野生型），PCR 鉴定引物位置示意图（可选择 P1,P2 引物对，或 P3,P4，P1,P4 引物对）。
目的基因组织特异性敲除效果验证：
DNA 水平 cre 活性验证通常是取一小块表达 Cre 的组织，抽提基因组 DNA，通过 PCR 的方法对 flox 区域进行扩增，通过 flox 区域的有无，定性判断 Cre 是否发挥作用。
RNA 水平 cre 敲除效率验证通常是取一小块表达 Cre 的组织，抽提 RNA，反转录成 cDNA 后，通过 Realtime-PCR 的方法，利用 Cre 作用后的 mRNA 所设计的引物无法扩增出 PCR 产物的原理，定量判断 Cre 作用效率。
蛋白水平 cre 敲除效率验证目的组织 western blot 或免疫组化检测。原理：表达 cre 的组织无法检测到目的蛋白。
动物组织 DNA 抽提：
250ul 裂解液 + 2.5ul proteinase K (10mg/ml) 直接消化组织，放于 55℃恒温热浴过夜。
加入同体积（250ul）苯酚：氯仿：异戊醇混合物（使用前摇晃瓶身混匀），上下剧烈震荡 15s，12000rpm,15min 常温离心。
转移上清于新的 EP 管（期间可能会吸起白色絮状物，无妨）。
加入等体积的异丙醇，上下剧烈震荡 15s,12000rpm,15min 常温离心。
倒掉上清（也可用真空泵吸，小心底部沉淀），用 75% 乙醇（400ul），7500rpm,5min（可多清洗 2 遍）。
将管壁内部及管盖上的残留乙醇吸干，沉淀相对较干，根据不同体积加入 ddH2O。
注：因没加 RNA 酶，可能会残余 RNA，A260/280 会居于 1.9 以上，但 PCR 无妨。
lysis buffer 配制（裂解液）：先加水 500ml，再加各种成分，最后定容到 1L。成分配置（1L）：1M Tris 8.0 -100x 10mL；5M Tris 8.0 -50x 20mL；0.5M EDTA-20x 50mL；10% SDS 50mL。
条件性基因敲除技术优势：避免全身性敲除小鼠可能出现的胚胎致死，通过与不同 Cre 小鼠交配，可使目的基因的缺失发生在实验动物发育的不同阶段或组织；若与控制 Cre 表达的其他诱导系统相结合，如 Cre/ERT、Tet/TetO-Cre 系统，则可以实现对目的基因同时在空间与时间两方面调控。
（二）肿瘤移植模型
皮下移植 CDX 模型：在异位移植中，皮下种植在背部或腋下是较常用的方法。该模型肿瘤形成率高，肿瘤周期短，易于控制肿瘤的大小和位置，个体差异小，对宿主的影响相似，容易客观判断疗效，但不能模拟肿瘤微环境。例如赛业生物已验证的皮下移植肝癌模型有 HepG2、HUH-7、Hep3B、HepG2-luc、Hep3B-luc、SK-Hep-1、Hepa1-6（鼠源）等。
原位移植 CDX 模型：与异位移植相比，原位移植可以进一步反映肿瘤的真实情况，提高肿瘤模型的可靠性。在原位移植模型中可诱导转移，表明肿瘤细胞和器官特异性因子可以相互作用，与肝癌的发生存在关联；原位移植还可以模拟肿瘤的免疫微环境。原位生长可以更好地模拟肿瘤细胞在体内生长的微环境，并且对药物疗效的预测更为准确。
PDX 模型：患者来源的异种移植物（PDX）模型存在两个问题，一是目前全球 PDX 的成功率都低于 20%；二是由于免疫缺陷鼠的 T 细胞免疫系统存在缺陷，该模型不适合免疫学研究。原位肿瘤容易形成单一肿瘤，但肿瘤团块的整体均匀性仍然较差，质量控制方法不如异位，无法进行荧光报告基因标记，在原位肝移植模型中检测肿瘤生长和药物反应的方法不如异位肝移植模型容易。
（三）基因编辑模型
使用 CRISPR/Cas9 等技术可以构建转基因型或基因敲除动物模型。例如：
利用 CRISPR/Cas9 技术建立 RelB 敲除小鼠模型：设计并构建针对目的基因 RelB 第 4 外显子 sgRNA，同时利用 T7 RNA 聚合酶体外转录 Cas9 mRNA。取 C57BL/6 小鼠受精卵体外注射 sgRNA 和 Cas9 mRNA 后，进行胚胎移植，实现靶基因敲除。待小鼠出生后提取 DNA 并进行 PCR 鉴定，获得 F0 代，后与野生型交配后繁殖，取样提取 DNA 测序分析鉴定后获得 F1 代小鼠，并在蛋白质水平，mRNA 水平和基因组水平分别验证敲除效果，成功获得了稳定遗传的 RelB 基因敲除小鼠。
利用 CRISPR/Cas9 技术高效构建巴马小型猪 F9 基因敲除细胞系：首先通过生物信息学方法对人和猪 F9 基因同源性进行分析，选取猪 F9 基因的第 2 外显子为敲除靶点，利用 CRISPR 在线靶点设计工具设计并合成单链向导 RNA（sgRNA），以 pX330 质粒为骨架构建打靶载体，同 G418 抗性质粒一同转染至野生巴马小型猪的胚胎成纤维细胞中，经药物 G418 筛选获得抗性单细胞克隆，测序并鉴定其基因型。
我国科学家创建世界首例生物节律紊乱体细胞克隆猴模型：利用基因编辑技术（CRISPR/Cas9），成功构建了世界首例核心节律基因 BMAL1 敲除猕猴模型，为脑认知功能研究、重大疾病早期诊断与干预、药物研发等提供新型高效的动物模型。
Science 子刊：浙大团队通过体内原位基因编辑，构建肝癌异质性小鼠模型库：选取 22 个高频驱动基因，以 TP53、CTNNB1 和 MYC 为基础与其他基因组合，激活的癌基因用 PB 转座子携带的激活突变体或野生型转基因来模拟，抑癌基因的失活则通过 sgRNA 和 Cas9 介导的基因敲除模拟。质粒体系通过尾静脉液态高压注射方法递送到肝细胞内发挥作用，建立了 25 种具有特定基因型的肝癌模型，并通过多组学联合分析阐明了这些模型的异质性特征。
全新 CRISPR/Cas9 基因敲入系统助力肝癌建模：研发出 CRISPR-SONIC 系统，利用 CRISPR/Cas9 基因编辑系统将致癌基因插入活小鼠的基因组，为肝癌中发病率第二的肝内胆管癌进行小鼠建模，在癌症建模中敲入了 KRAS，同时加入另一个向导 RNA 敲除了抑癌基因 TP53，注射进小鼠一个月后，小鼠肝脏中形成了肿瘤。
新型基因编辑肿瘤模型：发明了一种直接注射包含癌基因 / 抑癌基因抑癌序列的质粒溶液，从而模拟动物自然发生肿瘤的模型构建方法，一次性注射大量质粒，以弥补转染效率低的问题，保证有部分细胞能够转染成功，除了注射含目的基因的质粒外，同时还注射含转座酶基因的质粒，转座酶表达后将目的基因插入染色体，实现基因组发生基因突变，可在多种器官形成肿瘤，为探究肿瘤发生发展机制、寻找和优化新的肿瘤治疗方法提供了有利工具。
五、总结
不同的肝癌动物实验模型各具特点，构建方法也不尽相同。小鼠模型实验成本低、生存率高、遗传性状稳定，可通过诱发型、移植型、转基因型等方法造模；大鼠模型基因与人类相似、抗病力强、肝脏再生能力强，多采用诱发型造模；兔模型成型快、造模方法简单、肿瘤类型与人类巨块型肝癌类似，但易转移扩散；树鼩模型对肝炎病毒有易感性、进化水平高，可用于研究 HBV 与肝癌发病关系，但产仔少、胆小易受惊；土拨鼠模型在 HBV 研究中有独特优势，肝炎病毒与 HBV 同源性高、免疫反应相似、寿命长；斑马鱼模型与人类基因高度同源、生长发育快、透明胚胎便于观察，多采用转基因技术构建模型。
条件性敲除小鼠实验可实现目的基因在特定组织或细胞中的敲除，避免全身性敲除的胚胎致死问题，实现对目的基因的时空调控。肿瘤移植模型包括皮下移植 CDX 模型、原位移植 CDX 模型和 PDX 模型，各有优缺点。基因编辑模型利用 CRISPR/Cas9 等技术可构建转基因型或基因敲除动物模型。
在选择肝癌动物实验模型时，应根据研究目的进行选择。如果研究肝癌的发病机制，可选择自发型或诱发型模型；如果研究药物筛选和疗效，可选择移植型或基因编辑模型。总之，合适的模型选择对于肝癌研究至关重要。
