Tel：13770851495
一、引言
皮下荷瘤模型实验在肿瘤研究中具有重要意义，通过在动物体内建立肿瘤模型，为抗肿瘤药物的研发和肿瘤机制的研究提供了有力的工具。
皮下荷瘤实验是将肿瘤细胞移植到动物皮下，使其形成肿瘤块，从而进行肿瘤研究的一种常用方法。一般更多的时候是选择人源肿瘤细胞系，然而由于存在免疫排斥，需选择免疫缺陷动物荷瘤。下面以裸鼠为例，为大家详细介绍皮下荷瘤的实验过程。
（一）肿瘤细胞的传代扩增
取冻存于液氮的肿瘤细胞复苏并扩增，确保肿瘤细胞的活力和良好的生长状态。首先，从液氮罐里取出冻存的细胞株，进行细胞复苏，复苏后的细胞会渐渐恢复活力、迅速增殖。当贴壁生长的细胞覆盖了培养皿底面的 80% 以上时，就要进行细胞的传代培养，传代会给细胞提供更多的生长空间和足够的营养物质。
（二）计算细胞接种量
根据经验，一般鼠源肿瘤细胞接种 2～100 万 / 只，而人源肿瘤细胞则需要 200 - 1000 万 / 只以上。当然最好结合文献来确定细胞接种量，在找不到相关资料的情况下，最高就用到 1000 万 / 0.1ml，不可再高（因为细胞悬液已达饱和状态）。并且提前计算确定细胞数量，一般注射 40 只小鼠，至少需要准备 50 只小鼠的细胞量。
（三）准备裸鼠
一般选择 5 - 6W 裸鼠，小于 4W 动物可能不耐受而过早死亡，大于 6W 免疫力会增强，不易成瘤；每批实验只用同一性别动物，通常雌雄均可，但是根据研究的肿瘤类型及肿瘤细胞系选择（乳腺癌等要选择雌性，前列腺癌等要选择雄性）。
（四）操作步骤
接种时选择好部位进针，建议接种前酒精棉球擦拭消毒进针位置；
向前方穿行，注射前针头稍微动一动，能动说明在皮下，否则可能在皮内或者肌肉内；
针头在皮下走一段再注射，速度不可太快，一般体积为 100 - 200μL（PBS 或者无血清培养基稀释细胞，若不易成瘤可添加 matrigel 促进成瘤），可看见明显的鼓包；
接种点离进针点尽量较远，减少漏液和污染的可能；
注射完毕后，缓慢退出针头，尽量避免漏液；
细胞需一直置于冰上，使细胞处于比较低的代谢状态，一般 2h 之内不会有问题。
皮下荷瘤模型实验看似简单，实则有很多细节需要注意。不同细胞株的成瘤快慢会有差异，建议正式实验之前开展预实验，摸索细胞株成瘤性，同时参考已发文献。细胞培养操作过程要注意防止污染，尤其是支原体污染，会改变培养细胞的代谢、增殖特征及形态等，从而影响肿瘤生长和结果的可重复性。建议接种前对细胞进行支原体检测。细胞活力是影响肿瘤形成的重要原因，接种细胞建议取处于对数期生长的细胞，接种前对细胞活率进行检测，接种过程中细胞置于冰上，保持低温，接种完成后也可以留一小部分细胞检测细胞活率，确保接种过程中细胞活率没有明显降低。另外，注意避免体外过度传代影响细胞状态（一般 3 - 5 代）。
常用的免疫缺陷小鼠品系有：裸鼠、NOD - Scid、NCG 等。不同免疫缺陷程度的小鼠或小鼠不同周龄的成瘤速度有所差异，建议根据预实验结果选择合适的动物模型，同时参考已发表的文献。选择小鼠周龄不宜过大，如，裸鼠 8 周龄以上 NK 细胞等免疫细胞活力开始增强，一般来说，4～6 周龄的裸鼠更容易成瘤，这时免疫系统不够强，成瘤率相对较高。
皮下注射主要有 4 个位点，建议根据细胞株成瘤性和实验目的选择合适的接种部位。一般认为腋下皮下（3 号位）血供充足，利于肿瘤细胞增殖，且右侧操作较方便。如果个别瘤种生长速度较快，可以接种后肢或背部等供血量不是特别充足的地方，或者降低细胞接种剂量，减缓肿瘤生长速度。
不同的细胞系、不同的小鼠和接种位置所需要的细胞剂量会有差异，建议正式实验之前开展预实验，接种量设置多个梯度，摸索出最佳细胞注射剂量。另外，可以根据细胞株类型选择实验中是否需要添加辅助因子，如 matrigel、hormone 等。如果成瘤性不好，可尝试在细胞悬液（PBS 溶）中添加基质胶（根据说明书比例，一般体积比 1：1，冰上操作），提供细胞外基质营养。卵巢癌一般均会加雌激素，接种细胞后单独注射雌激素。
小鼠在运输过程中会产生应激反应，使小鼠出现一系列的病理生理学变化，这些变化会增加某些实验误差，因此在接到动物后应尽量避免立即进行实验，建议让动物有 1~2 周的适应期。小鼠饲养环境较差会影响小鼠状态，进而影响实验结果，严重时造成小鼠死亡。免疫缺陷小鼠对饲养环境的要求很高，必须饲养在 SPF 级屏障设施内，且与免疫正常小鼠饲养在不同房间。如果环境设施不达标，有可能会间接影响肿瘤模型的制备：裸鼠长期暴露在弱抗原的刺激下，NK 细胞等免疫细胞的活力逐步增强，会导致裸鼠对肿瘤的非特异性免疫力增强；NCG 及 NCG 相关背景品系是重度免疫缺陷模型，对病原体易感，饲养环境清洁消毒不足，会造成环境微生物富集，对这一类小鼠带来健康风险。
荷瘤实验是否成功受很多因素的影响，以上建议仅供参考。另外，个体差异无法避免，肿瘤生长的速度可能不完全同步，实验中建议适当增加小鼠的富余量。
二、实验准备
1. 肿瘤细胞的传代扩增
首先从液氮罐中取出冻存的肿瘤细胞进行复苏。复苏后的细胞会逐渐恢复活力，开始迅速增殖。当贴壁生长的细胞覆盖培养皿底面达到 80% 以上时，就需要进行细胞的传代培养。传代可以为细胞提供更多的生长空间和充足的营养物质，确保肿瘤细胞保持良好的生长状态和活力。
2. 计算细胞接种量
根据经验和文献，确定合适的细胞接种量至关重要。一般来说，鼠源肿瘤细胞接种量为 2～100 万 / 只，人源肿瘤细胞则需要 200 - 1000 万 / 只以上。在找不到相关资料时，最高可使用 1000 万 / 0.1ml，但不能再高，因为此时细胞悬液已达饱和状态。同时，要提前计算确定细胞数量，通常注射 40 只小鼠，至少需要准备 50 只小鼠的细胞量。
3. 准备裸鼠
实验中一般选择 5 - 6W 的裸鼠。小于 4W 的裸鼠可能因不耐受而过早死亡，而大于 6W 的裸鼠免疫力会增强，不易成瘤。每批实验应只用同一性别动物，通常雌雄均可，但要根据肿瘤类型及细胞系进行选择，比如乳腺癌等应选择雌性，前列腺癌等则选择雄性。
三、实验操作
1. 操作步骤
在进行动物实验建立皮下荷瘤模型时，操作步骤需严格遵循以下要点，以确保实验的准确性和可靠性。
接种前酒精棉球擦拭消毒进针位置。这一步骤能够有效降低感染的风险，为后续的操作提供一个相对清洁的环境。
进针后确认在皮下，不在皮内或肌肉内。进针时需小心操作，向前方穿行，注射前针头稍微动一动，能动说明在皮下，否则可能在皮内或者肌肉内。这样可以确保肿瘤细胞准确地注射到皮下位置，避免因注射位置错误而影响实验结果。
针头在皮下走一段再注射，速度不可太快，体积为 100 - 200μL，可添加 matrigel 促进成瘤。一般用 PBS 或者无血清培养基稀释细胞，若不易成瘤可添加 matrigel，提供细胞外基质营养，促进肿瘤形成。注射速度不宜过快，以防止细胞分布不均匀或对小鼠造成不必要的损伤。
接种点离进针点尽量远，减少漏液和污染。这样可以最大限度地降低污染的可能性，确保实验的准确性。
注射完毕后缓慢退出针头，避免漏液。缓慢退出针头可以减少对注射部位的刺激，降低漏液的风险。
细胞需一直置于冰上，保持低代谢状态。细胞置于冰上可以使其处于比较低的代谢状态，一般 2h 之内不会有问题，保证细胞的活力和良好的生长状态。
2. 后续实验安排
分组：分为对照组、阳性药物组、低中高剂量药物组等。一般来说皮下荷瘤主要用于抗肿瘤药物的检测，因此我们通常将实验小鼠分为对照组，给予生理盐水或其他药物的溶剂等阴性处理；阳性药物组，给予已知有效的药物处理；低剂量、中剂量及高剂量药物组，用于测试不同剂量药物的抗肿瘤效果。
数量：每组不少于 10 只，确保最终获取 6 个有效数据。考虑到小鼠成瘤率和死亡原因，每组需要一定数量的小鼠，以保证最终能够获得足够的有效数据进行分析。
给药时间：一般接种 7 - 10 天后分组实验。鼠源细胞系通常生长速度较快，一般接种 7 - 10 天后便可看到肿瘤长起，此时便可进行分组实验。
人道终点：遵循动物伦理学规定，出现特定情况对动物施行安乐死。动物伦理学规定，小鼠肿瘤重量不可超过小鼠体重 10%，平均肿瘤直径不超过 20mm，并且如果出现溃烂，造成感染或坏死时，应该中止实验且对动物施行安乐死。这样可以确保实验动物在实验过程中受到最小的痛苦和伤害。
四、影响因素
1. 细胞因素
细胞系特性：不同的细胞株成瘤快慢存在差异，这是因为不同细胞株具有独特的生物学特性。为了确保实验的准确性和可靠性，在正式实验之前，应开展预实验来摸索细胞株的成瘤性，同时参考已发表的文献。这样可以更好地了解不同细胞株的特点，为后续实验选择合适的细胞株提供依据。
细胞状态：细胞培养操作过程中要特别注意防止污染，尤其是支原体污染。支原体污染极为常见，它会改变培养细胞的代谢、增殖特征及形态等，进而影响肿瘤生长和结果的可重复性。因此，建议在接种前对细胞进行支原体检测。此外，细胞活力是影响肿瘤形成的重要因素。接种细胞应选取处于对数期生长的细胞，接种前对细胞活率进行检测，接种过程中将细胞置于冰上，保持低温，以降低细胞代谢速度。接种完成后，也可以留一小部分细胞检测细胞活率，确保接种过程中细胞活率没有明显降低。同时，要注意避免体外过度传代影响细胞状态，一般传代 3 - 5 代为宜。
2. 动物因素
选择合适的免疫缺陷小鼠品系对于皮下荷瘤实验至关重要。常用的免疫缺陷小鼠品系有裸鼠、NOD - Scid、NCG 等。不同免疫缺陷程度的小鼠或小鼠不同周龄的成瘤速度有所差异。因此，建议根据预实验结果和已发表的文献选择合适的动物模型。一般来说，选择小鼠周龄不宜过大，如裸鼠 8 周龄以上 NK 细胞等免疫细胞活力开始增强，4～6 周龄的裸鼠更容易成瘤，这时免疫系统不够强，成瘤率相对较高。
3. 接种部位因素
根据细胞株成瘤性和实验目的选择合适的接种部位是提高实验成功率的关键之一。皮下注射主要有 4 个位点，一般认为腋下皮下（3 号位）血供充足，利于肿瘤细胞增殖，且右侧操作较方便。如果个别瘤种生长速度较快，可以接种后肢或背部等供血量不是特别充足的地方，或者降低细胞接种剂量，以减缓肿瘤生长速度。
4. 接种量因素
不同的细胞系、不同的小鼠和接种位置所需要的细胞剂量会有差异。因此，在正式实验之前，应开展预实验，设置多个接种量梯度，摸索出最佳细胞注射剂量。另外，可以根据细胞株类型选择实验中是否需要添加辅助因子，如 matrigel、hormone 等。如果成瘤性不好，可尝试在细胞悬液（PBS 溶）中添加基质胶（根据说明书比例，一般体积比 1：1，冰上操作），为细胞提供细胞外基质营养。例如，卵巢癌一般均会加雌激素，接种细胞后单独注射雌激素。
5. 饲养管理因素
小鼠在运输过程中会产生应激反应，使小鼠出现一系列的病理生理学变化，这些变化会增加某些实验误差。因此，在接到动物后应尽量避免立即进行实验，建议让动物有 1 - 2 周的适应期。此外，免疫缺陷小鼠对饲养环境的要求很高，必须饲养在 SPF 级屏障设施内，且与免疫正常小鼠饲养在不同房间。如果环境设施不达标，有可能会间接影响肿瘤模型的制备。例如，裸鼠长期暴露在弱抗原的刺激下，NK 细胞等免疫细胞的活力逐步增强，会导致裸鼠对肿瘤的非特异性免疫力增强；NCG 及 NCG 相关背景品系是重度免疫缺陷模型，对病原体易感，饲养环境清洁消毒不足，会造成环境微生物富集，对这一类小鼠带来健康风险。
五、常见问题及解决方法
1. 瘤子长不出来
如果出现瘤子长不出来的情况，可能是细胞状态差、活力不好，或肿瘤细胞不易成瘤。此时可以考虑加入 Matrigel 辅助、增大接种量或更换细胞系。另外，也有可能是小鼠周龄太大或免疫排斥导致的，可更换免疫缺陷程度更大的小鼠，如 Nod-scid 小鼠、NOG 小鼠等。
2. 小鼠瘤子长起来又消失
小鼠瘤子长起来又消失可能是炎症反应，肿瘤细胞被小鼠自身吸收。若出现这种情况，可以继续观察肿瘤细胞吸收之后是否经过几周还能长出来，若长不起来建议换鼠。
3. 肿瘤体积差距较大
当荷瘤分组发现小鼠肿瘤体积差距很大时，可能是由于小鼠周龄及接种细胞量不一致导致的。建议重新做实验分组，以确保实验的准确性和可靠性。
4. 一只小鼠能否多个点荷瘤
一只老鼠只能接种一个点，不可以多个点荷瘤。因为一个老鼠身上有多个肿瘤块的情况下，可能会相互影响。
5. 是否应用免疫抑制剂加速肿瘤生长
如果裸鼠荷瘤不生长，可以参考文献使用免疫抑制剂，但可能会造成溃烂，应尽量符合细胞系生长特性，避免人为干扰。一般情况下，不建议为了缩短造模周期而使用免疫抑制剂加速肿瘤生长，以免造成实验被迫中止。
六、结论
皮下荷瘤模型实验看似简单，实则有很多不可忽视的因素需要考虑。通过精准的操作和对关键要点的把握，可以提高实验的成功率，为肿瘤研究提供可靠的动物模型。
在进行皮下荷瘤模型实验时，从肿瘤细胞的传代扩增到准备裸鼠，再到具体的操作步骤以及后续实验安排，每一个环节都至关重要。不同细胞株的成瘤特性各异，细胞状态、动物因素、接种部位、接种量以及饲养管理等都会影响实验结果。
例如，细胞培养过程中要防止污染，尤其是支原体污染，会严重影响肿瘤生长和结果的可重复性。同时，选择处于对数期生长的细胞，保持细胞活力，并注意避免体外过度传代。在选择免疫缺陷小鼠品系时，要根据预实验结果和文献参考，考虑小鼠的周龄和成瘤速度差异。接种部位的选择应根据细胞株成瘤性和实验目的来确定，不同的细胞系、小鼠和接种位置所需的细胞剂量也不同，需要通过预实验摸索最佳注射剂量。此外，小鼠的饲养管理也不能忽视，运输后的适应期和良好的饲养环境对实验结果至关重要。
总之，皮下荷瘤模型实验需要综合考虑各种因素，严格按照操作规范进行，以确保实验的准确性和可靠性，为肿瘤研究提供有力的支持。
