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一、引言
细胞培养是生物学和医学研究中的重要技术手段，而单层贴壁细胞的传代操作则是细胞培养过程中的关键环节。本文将详细介绍单层贴壁细胞的传代方法，帮助读者更好地掌握这一技术。
细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代。传代培养不仅是一种将细胞种保存下去的方法，也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
单层贴壁细胞传代主要包括以下几个步骤：传代前准备、胰蛋白酶消化、吹打分散细胞、分装稀释细胞和继续培养。
（一）传代前准备
预热培养用液：把已经配制好的培养液、PBS 液和胰蛋白酶的瓶子放入 37℃水浴锅内预热。
消毒：用 75％酒精棉球擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
点燃酒精灯：注意火焰不能太小。
超净工作台内拆除已消毒空培养瓶的外包装。
取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后放入超净工作台内。
从培养箱内取出细胞：注意取出时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在显微镜下观察细胞。
打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。
（二）胰蛋白酶消化
加入消化液：小心吸出旧培养液，用 PBS 清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞，消化温度是 37℃。
显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。
终止消化：加入与消化液等体积的新鲜培养液。
（三）吹打分散细胞
打成悬液：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。
吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入 10 mL 离心管中。
平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以 1000r／min 离心 5 min。
弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入 2mL 培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。
（四）分装稀释细胞
分装：将细胞悬液吸出分装至 2—3 个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。
显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要时计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于 5×105 个／mL。做好标记。
（五）继续培养
用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入 CO2 培养箱中继续培养。传代细胞 2h 后开始贴附在瓶壁上。
在进行单层贴壁细胞传代时，还需要注意以下事项：
严格的无菌操作。
适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。
二、单层贴壁细胞传代的重要性
单层贴壁细胞传代具有多方面的重要意义。
首先，对于细胞生长而言，当细胞在培养瓶长成致密单层后，继续生长的空间不足，培养基中的营养成份也消耗较多，同时代谢废物堆积，传代可以为细胞提供更充足的生长空间和新鲜的营养物质，促进细胞的持续生长和增殖。
其次，在实验研究中，传代培养不仅是一种将细胞种保存下去的方法，还能确保实验有足够的细胞数量，满足各种细胞实验的需求。通过传代，可以将细胞在不同的实验条件下进行培养和观察，为研究细胞的生物学特性、药物反应等提供基础。
最后，从细胞保存的角度看，传代可以扩大细胞数量，避免细胞因老化或其他原因而死亡，确保细胞资源的可持续利用。同时，传代过程中的细胞冻存等技术，可以将细胞在特定状态下保存起来，以备后续实验使用。
三、单层贴壁细胞传代流程
传代前准备
预热培养用液，包括培养液、PBS 液和胰蛋白酶。把已经配制好的这些液体的瓶子放入 37℃水浴锅内预热，为后续的细胞传代操作提供适宜温度的液体。
消毒超净工作台和双手。用 75％酒精棉球擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手，确保操作环境的无菌。
正确摆放器械，保证操作空间。合理摆放使用的器械，不仅便于操作而且可减少污染。
点燃酒精灯。注意火焰不能太小，为操作提供稳定的热源。
拆除已消毒空培养瓶外包装。在超净工作台内拆除已消毒空培养瓶的外包装，准备用于细胞的分装。
取出预热好的培养用液。取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后放入超净工作台内。
从培养箱内取出细胞并观察。注意取出时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在显微镜下观察细胞的生长状态。
打开瓶口并烧口消毒。将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒，防止细菌污染。
胰蛋白酶消化
小心吸出旧培养液，用 PBS 清洗，加入适量胰蛋白酶液。小心吸出旧培养液，用 PBS 清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞，消化温度是 37℃。
显微镜下观察细胞消化情况。倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。
加入与消化液等体积的新鲜培养液终止消化。当细胞消化适度时，加入与消化液等体积的新鲜培养液，终止消化过程。
吹打分散细胞
将消化后的细胞吹打成细胞悬液。用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液，使细胞均匀分散。
吸入离心管并离心。将细胞悬液吸入 10 mL 离心管中，平衡后将离心管放入台式离心机中，以 1000r／min 离心 5 min。
弃上清液，加入新培养液制成细胞悬液。弃去上清液，加入 2mL 培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。
分装稀释细胞
将细胞悬液分装至培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。将细胞悬液吸出分装至 2—3 个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。
显微镜下观察细胞量并计数。倒置显微镜下观察细胞量，必要时计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于 5×105 个／mL。做好标记。
继续培养
擦拭培养瓶，旋松瓶盖，放入 CO?培养箱中继续培养。用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入 CO2 培养箱中继续培养。传代细胞 2h 后开始贴附在瓶壁上。
四、注意事项
在进行单层贴壁细胞传代时，以下注意事项至关重要：
严格无菌操作，包括操作前洗手、超净台消毒等。细胞培养过程中，任何细菌、真菌或其他微生物的污染都可能导致实验失败。因此，在进行传代操作时，必须确保操作环境的无菌，所有使用的器械和试剂都要经过严格的消毒处理。
适度消化，注意消化时间和消化液浓度。消化的时间受多种因素影响，如消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等。在消化过程中，应密切观察细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。如果消化时间过长，细胞可能会受到过度损伤，影响细胞的活性和生长能力；如果消化时间过短，细胞可能无法充分解离，影响传代效果。
不同细胞采用不同消化措施。不同的细胞对消化液的反应不同，有的敏感，有的迟钝。因此，应根据所用细胞的特点制定适宜的消化措施。例如，对于贴壁不牢的细胞，可以用吸管直接吹下，但这样容易伤害细胞，细胞大片脱落掉，不易计数，应尽可能采用消化法分散细胞为妥。对于较难消化的细胞，可以适当延长消化时间或增加消化液的浓度，但要注意避免过度消化。
保证细胞受损害少，细胞悬液均匀。消化传代良好时，细胞受损害少，细胞悬液均匀，各分装样品中数量误差小，细胞生长增殖速度一致，实验结果可靠性大。为了达到这一目的，在消化和吹打细胞时要轻柔，避免用力过猛导致细胞破损。同时，要确保细胞悬液充分混合均匀，以便在分装时每个培养瓶中的细胞数量和状态基本一致。
操作动作准确敏捷，避免增加污染机会。在进行传代操作时，动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰，以减少空气中的微生物污染细胞的可能性。同时，要注意不同细胞、不同操作之间换枪头，避免交叉污染。
不同细胞、不同操作之间换枪头。为了防止交叉污染，在进行不同细胞的传代操作或同一细胞的不同操作步骤时，必须更换枪头。这样可以避免将一种细胞的污染物质带入另一种细胞，或者将上一步操作的残留物质带入下一步操作，从而保证实验的准确性和可靠性。
五、总结
单层贴壁细胞传代是细胞培养中的关键步骤，掌握正确的操作方法和注意事项至关重要。
关键步骤总结：
传代前准备：包括预热培养用液、消毒、正确摆放器械、点燃酒精灯、拆除培养瓶外包装、取出预热好的液体、取出细胞并观察、打开瓶口消毒等，为后续操作创造无菌且适宜的环境。
胰蛋白酶消化：小心吸出旧培养液，用 PBS 清洗后加入适量胰蛋白酶液，在 37℃下观察细胞消化情况，胞质回缩、细胞不再连接成片时加入新鲜培养液终止消化。
吹打分散细胞：将消化后的细胞吹打成悬液，吸入离心管离心后弃上清液，加入新培养液制成细胞悬液。
分装稀释细胞：将细胞悬液分装至培养瓶中，加入适量培养基并在显微镜下观察细胞量，必要时计数，确保密度不低于 5×105 个／mL，做好标记。
继续培养：用酒精棉球擦拭培养瓶，旋松瓶盖放入 CO?培养箱中，传代细胞 2h 后开始贴附在瓶壁上。
注意事项强调：
严格无菌操作是基础，从操作前洗手、超净台消毒到所有器械和试剂的严格消毒处理，确保细胞培养过程不受微生物污染。
适度消化至关重要，消化时间受多种因素影响，需密切观察细胞形态变化，及时终止消化，避免过度或不足消化对细胞活性和生长能力造成影响。
不同细胞应采用不同消化措施，根据细胞特点制定适宜的消化方法，如对贴壁不牢的细胞尽量采用消化法，对难消化的细胞可适当延长消化时间或增加消化液浓度。
保证细胞受损害少且悬液均匀，轻柔操作避免细胞破损，充分混合确保分装时细胞数量和状态一致，以提高实验结果的可靠性。
操作动作要准确敏捷但不能太快，减少污染机会，所有操作靠近酒精灯火焰，不同细胞和操作之间换枪头防止交叉污染。
正确进行单层贴壁细胞传代操作，不仅能为细胞提供良好的生长环境，促进细胞的持续生长和增殖，还能为各种细胞实验提供充足的细胞资源，确保实验的顺利进行。
