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一、引言
细胞划痕实验和 Transwell 实验是研究细胞迁移的常用方法，它们各有特点，适用于不同的研究场景。本文将详细介绍这两种实验方法的区别和应用。
细胞迁移和侵袭在生物学研究中具有重要意义，尤其是在肿瘤恶性化表型研究中。了解细胞迁移机制对于癌症研究至关重要，而抑制肿瘤细胞迁移和侵袭是有效的治疗手段。检测细胞迁移能力最常见的方法是细胞划痕实验和 Transwell 小室检测。
细胞划痕实验是一种操作简单、经济实惠的研究细胞迁移的体外试验方法，类似体外伤口愈合模型，主要用于检测细胞在 2D 空间中的迁移能力。其基本原理是在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上，用微量枪头或其它硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，然后继续培养细胞至实验设定的时间，依据划痕边缘细胞逐渐进入空白区域使 “划痕” 愈合的能力，判断细胞生长迁移能力。
Transwell 小室检测则是将小室放入孔板中，小室内含有密密麻麻的小孔，将细胞悬液加到小室中，小室放在加入完全培养基的孔板内，细胞可通过形变穿过小室中的孔而跑到营养更丰富的小室外部并贴在外侧。通过对小室外部的细胞进行染色计数，就可以判断细胞的迁移与侵袭能力的强弱。
这两种实验方法各有优缺点。细胞划痕实验操作简便，不需要借助特殊的实验仪器，实验成本低，但操作者划痕易出现宽度不均一，影响划痕愈合度评估，且划痕会对周围细胞造成机械损伤，影响细胞活性，不太好排除增殖带来的影响。Transwell 小室检测成本较高，但可以模拟细胞在 3D 空间的迁移，且能进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多方面研究。
二、细胞划痕实验
1. 实验原理及特点
细胞划痕实验是通过在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，模拟体内细胞迁移过程，观察划痕边缘的细胞逐渐进入空白区域使 “划痕” 愈合的情况，从而研究细胞迁移运动、修复能力和细胞间相互作用。特点如下：
操作简单：仅需常规的细胞培养设备和工具，如细胞计数仪、培养箱、倒置显微镜、移液枪等。
经济实惠：相比其他复杂的细胞迁移实验方法，成本较低。
与显微镜系统兼容：可方便地通过显微镜观察和记录细胞迁移过程，与包括活细胞成像在内的显微镜系统兼容，便于分析细胞间的相互作用。
2. 实验步骤
培养板划线 — 铺板 — 细胞划线 — 清洗 — 细胞培养观察 — 结果分析。
划线：先用 marker 笔在 6 孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔 0.5 - 1cm 一道，横穿过孔，每孔至少穿过 5 条线。划线目的是为了辅助划痕时划得更直，有利于后续拍照分析，拍照前会擦去划线。
铺板：将处于对数生长期的细胞，胰蛋白酶消化成单细胞悬液，接种于 6 孔培养板。细胞铺板数量一般为每孔约 5 - 10×105 个细胞，接种原则为过夜后融合率达到 100%，每孔最终的培养基总量 2mL。实验时应注意细胞生长状况，选择适当的细胞接种浓度，可先进行预实验确定最佳接种数量和培养时间，保证培养终止时密度适当，细胞间没有空隙。
细胞划线：第二天用 200 微升枪头比着 6 孔板盖子或直尺，平行或垂直于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。同浓度不同孔之间划痕最好使用同一只枪头，减少划痕距离的误差，保持力度一致，一次性划完。有条件的话，可以选择 culture Insert，将细胞接种于 Dish 中间的 Insert，培养后用镊子移除 Insert 即可产生宽度一致的划痕。
清洗：PBS 冲洗细胞 3 次，除去划下的细胞，加入无血清培养基。冲洗时要温柔，贴壁加入，避免冲掉单层细胞，反复多次冲洗，尽量洗掉所有的细胞碎片。
细胞培养观察：将培养板放入 37℃、5％CO2 培养箱中培养，可按 0，6，12，24h 时间点取样，拍照。注意擦去 6 孔板背后的 marker 横线划痕，4 倍镜下进行拍照，保证划痕居中且垂直，注意背景一致，加入待测样本，设置浓度梯度。
结果分析：使用 Image J 软件打开图片后，随机划取 6 至 8 条水平线，计算细胞间距离的均值或者划痕面积均值。
3. 注意事项
铺板选择 6 孔板较好，保证划痕平直且有定位线。6 孔板可以保证有相当距离的平直划痕，而且因为有 5 条定位线，与划痕相交，这样就有 10 个可固定监测点，不作重复，误差也很小。
选择适当细胞接种浓度，注意细胞生长状况。根据细胞生长速度和状态确定接种数量，保证过夜后融合率达到 100%，即细胞间没有空隙，否则会影响后续拍照分析。
采用低血清培养基培养，减少细胞增殖影响。使用无血清或低血清培养基（＜2%）可降低细胞增殖对实验结果的影响；一般认为 24h 为细胞的一个周期，在选取合适的时间点（6，12，24h）检测划痕宽度时，最好不要超过细胞一个周期的时间；如果要单纯考虑细胞迁移，可以先用丝裂霉素（1μg/ml）处理 1h，抑制细胞的分裂。
三、Transwell 实验
1. 实验原理及特点
Transwell 小室放入培养板中，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，细胞可通过形变穿过小室中的孔而跑到营养更丰富的小室外部并贴在外侧，通过对小室外部的细胞进行染色计数，判断细胞的迁移与侵袭能力的强弱。
Transwell 实验的特点主要有以下几点：
可模拟细胞在 3D 空间的迁移，更准确地测量细胞的迁移和侵袭能力。
应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多方面研究。
可选择聚酯（PET）或胶原包被的 PTFE 膜，聚酯 Transwell 嵌套透明，带有一层透明的膜，可以让细胞更好的贴附和生长；Transwell-COL 嵌套含有牛胎盘中提取的等摩尔数混合 I 型和 III 型胶原，使细胞更易贴附和伸展，同时在培养的过程中可以观察。
2. 实验步骤
准备细胞：饥饿处理同步细胞周期，制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿 12－24h，进一步去除血清的影响，但这一步并不是必须的。消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用 PBS 洗 1－2 遍，用无血清培养基重悬。
准备 Transwell 小室：根据实验设计选择是否添加基质胶。如进行侵袭实验，将 Matrigel 胶从 -20℃取出于 4℃冰箱过夜，在 4℃条件下将 Matrigel 胶用无血清的细胞培养基稀释至 300 μl/ml，取 100 μl 均匀涂抹一层于细胞培养池的 PET 膜上表面，然后将培养池轻轻放入 24 孔板孔内，37℃放置 3 h 左右，取出于超净工作台过夜干燥；如进行迁移实验，则跳过这一步骤。
细胞悬液制备：用无血清培养基调整细胞浓度，计数，调整浓度为 2×10?/ml。
添加诱导因素：在下室加入诱导剂，在下室（即 24 孔板底部）加入 600－800 μl 含 10％血清的培养基。
接种细胞：将细胞悬液加入上室，上室加入 100－150 μl 细胞悬液。
培养：在培养箱中培养 24 - 48h，常规培养 12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。
固定和染色：取出 Transwell 小室，弃去孔中培养液，用无钙的 PBS 洗 2 遍，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，甲醇或者甲醛固定 30 分钟，将小室适当风干。用 0.1% 结晶紫染色 30 - 60 min，用 PBS 洗 3 遍。用棉签轻轻擦掉上室水分。
迁移 / 侵袭细胞计数：400 倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。
数据分析：计算细胞迁移或侵袭的百分率等统计数据。
3. 注意事项
避免气泡产生。下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，因此在种板的时候要特别留心。一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。
确保涂层均匀。铺胶时，尽量垂直小室底部在小室底部中间加入，可避免气泡的产生；注意铺胶过程不要产生气泡，铺胶均匀，否则影响实验结果；铺胶的厚度自己摸索，25ul，40ul，100ul。
控制细胞密度。细胞悬液的制备数量要合适，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。肿瘤细胞数目需要摸浓度，从 2 万，5 万，10 万。
优化培养时间和条件。培养细胞的时间为 24h 较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。所有细胞培养试剂和细胞培养池放在 37℃温育。
精确调整化学吸引剂浓度。下室加入诱导剂，若研究细胞侵袭实验，24 孔板下室一般加入 600μl 含 15% FBS 的培养基，上层的培养基为无血清培养基，下室的培养基为 15% 的血清培养基，这个浓度可以改成 20%，细胞数不够，底下的吸引力也不够不行；若研究细胞趋化作用，下室加入某种趋化因子。
选择适合细胞大小的膜孔径。Transwell 嵌套提供从 0.4um 到 12.0um 多种孔径，选择需要考虑实验的目的和实验细胞的大小。如不涉及研究细胞运动能力通常是选择 4μm 或者 3μm；共培养体系细胞在滤膜孔径小于 3.0μm 的条件下不会通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力、不需细胞穿过滤膜时，则应选择 3.0μm 以下孔径，常用 0.4、3.0μm；肿瘤细胞迁移实验常用 8.0、12.0um 膜；肿瘤细胞侵袭实验常用 8.0、12.0um 膜。
避免交叉污染。注意无菌操作，铺胶之前将枪头以及所用的耗材至于冰箱 4 度当中，否则配胶的时候会直接凝固。
使用一致的显微镜设置和图像分析方法。镜下对染色后的细胞进行计数，计算中间和四周 5 个视野，取平均值。拍照前需适当晾干小室，水分会影响镜下视野；用 PBS 清洗小室时，需避物理触碰小室底部，可以准备几个无菌烧杯或培养皿，倒入适量 PBS，依次涮洗，可提高效率。
四、两种实验方法的区别
1. 模拟环境不同
细胞划痕实验模拟单层细胞在 2D 平面的迁移，通过在单层贴壁细胞上制造划痕，观察细胞在平面上向空白区域的迁移情况，类似体外伤口愈合模型。而 Transwell 实验模拟细胞在 3D 空间的迁移，小室上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，细胞可穿过膜上的小孔跑到营养更丰富的小室外部，更接近体内细胞穿越基底膜和细胞外基质的行为。
2. 成本不同
细胞划痕实验成本较低，仅需常规的细胞培养设备和工具，如细胞计数仪、培养箱、倒置显微镜、移液枪等，且实验操作相对简单，不需要特殊的实验仪器。而 Transwell 实验成本较高，涉及到 Transwell 小室、基质胶等材料，且实验步骤相对复杂，需要精确控制各种实验条件。
3. 准确性不同
Transwell 实验更准确地测量细胞的迁移和侵袭能力。Transwell 小室的设计能够模拟细胞在体内的迁移和侵袭过程，通过对小室外部的细胞进行染色计数，可以更直观地观察和评估细胞的迁移和侵袭能力。而细胞划痕实验虽然操作简便，但存在操作者划痕宽度不均一、对周围细胞造成机械损伤以及难以排除增殖带来的影响等问题，可能会影响划痕愈合度的评估准确性。
五、应用场景
1. 细胞划痕实验应用
细胞划痕实验适合初步评估细胞迁移能力和细胞 — 细胞相互作用。例如，在研究癌症组织中某个因子对肿瘤细胞迁移的影响时，细胞划痕实验可以快速、直观地观察到细胞在二维平面上的迁移情况。通过在单层贴壁细胞上制造划痕，模拟体内伤口愈合过程，观察肿瘤细胞在特定因子作用下向划痕区域的迁移速度和程度，从而初步判断该因子对肿瘤细胞迁移能力的影响。同时，细胞划痕实验也可用于研究不同细胞之间的相互作用，观察一种细胞的存在对另一种细胞迁移能力的影响。
2. Transwell 实验应用
Transwell 实验主要应用于细胞迁移、细胞侵袭性以及筛选抗癌药物等方面的研究。在研究肿瘤细胞的侵袭能力时，Transwell 实验可以更准确地模拟细胞在体内穿越基底膜和细胞外基质的过程。通过在小室膜上涂抹基质胶，肿瘤细胞需要分泌基质金属蛋白酶降解基质胶后才能穿过膜到达下室，从而可以定量分析肿瘤细胞的侵袭能力。此外，Transwell 实验还可用于评估药物对细胞迁移和侵袭能力的影响。在小室上下室分别加入不同浓度的药物和含血清的培养基，观察药物作用下细胞穿过膜的数量变化，为筛选抗癌药物提供实验依据。
六、结论
细胞划痕实验和 Transwell 实验各有优缺点，科研人员应根据具体的研究目的和需求选择合适的方法来开展细胞迁移研究，进一步揭示细胞迁移的调控机制和相关生物学过程。
细胞划痕实验操作简单、成本低，适合初步评估细胞迁移能力和细胞 — 细胞相互作用。然而，由于操作者划痕易出现宽度不均一、对周围细胞造成机械损伤以及难以排除增殖带来的影响等问题，可能会影响划痕愈合度的评估准确性。
Transwell 实验成本较高，步骤相对复杂，但更准确地测量细胞的迁移和侵袭能力，可模拟细胞在 3D 空间的迁移，且能进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多方面研究。
在实际应用中，若需要快速、直观地观察细胞在二维平面上的迁移情况，或研究不同细胞之间的相互作用，细胞划痕实验是一个不错的选择。而当需要更准确地评估细胞的迁移和侵袭能力，尤其是模拟细胞在体内穿越基底膜和细胞外基质的过程时，Transwell 实验则更为合适。
总之，两种实验方法各有其独特的价值，科研人员应根据具体情况进行选择，以更好地开展细胞迁移研究。
