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一、引言
动物免疫组化实验在生物学和医学领域中具有重要意义，它能够帮助科研人员深入了解动物组织中特定抗原的分布和表达情况，为疾病诊断和研究提供关键信息。然而，在动物免疫组化实验中，组织固定环节至关重要，如果出现问题，可能会带来严重后果。
组织固定不良可能导致抗原丢失、组织形态改变、背景染色增加等问题，从而影响实验结果的准确性和可靠性。例如，固定不充分可能使抗原无法被抗体有效识别，导致假阴性结果；而过度固定则可能封闭抗原决定簇，同样影响抗体与抗原的结合，也会出现假阴性情况。此外，固定不良还可能使组织变得脆弱，在后续的切片等操作过程中容易破碎，影响实验的顺利进行。
因此，探讨动物免疫组化实验中组织固定出问题后的补救方法具有重要的现实意义。接下来，我们将深入探讨可能的补救措施。
二、组织固定不良的后果
1. 实验失败风险增加
在动物免疫组化实验中，组织固定不良会带来诸多严重后果，极大地增加实验失败的风险。
首先，组织固定不到位可能导致抗原丢失。例如，若固定不充分，抗原无法被抗体有效识别，容易出现假阴性结果。同时，过度固定也可能封闭抗原决定簇，影响抗体与抗原的结合，同样会产生假阴性情况。这就如同在一场关键的 “抗原 - 抗体结合之战” 中，由于固定不良，抗原要么 “躲起来” 让抗体找不到，要么被过度 “束缚” 无法与抗体互动。
其次，组织形态改变也是固定不良的常见后果。不恰当的固定会使组织变得脆弱，在后续的切片等操作过程中容易破碎，影响实验的顺利进行。就像一座根基不稳固的建筑，随时可能崩塌，无法承受进一步的 “雕琢”。
此外，背景染色增加也不容忽视。固定不良会使组织固定不充分，抗原扩散，进而导致背景染色增加。这就如同在一幅原本清晰的画面上蒙上了一层模糊的阴影，让我们难以分辨真正的目标信号。
总之，组织固定不良会引发一系列问题，直接威胁到动物免疫组化实验的最终结果，使实验失败的风险大幅增加。
三、组织固定不良的补救方法
1. 具体步骤
当动物免疫组化实验中组织固定不良时，可以采取以下步骤进行补救：
融蜡除蜡：把已包埋的固定不良的组织重新放入石蜡中融蜡，使组织周围多余的蜡去除。
二甲苯脱蜡：把已除去石蜡的组织放入二甲苯 Ⅰ（或环保脱蜡剂）中 30 分钟，二甲苯 Ⅱ 30 分钟，以去除组织内含有的石蜡。
乙醇逐级浸泡：把经过两道二甲苯的组织重新逐级放入乙醇；无水乙醇 Ⅰ→无水乙醇 Ⅱ→95% 乙醇→80% 乙醇中各 20 分钟，注意各级乙醇应是初次使用且不可重复使用。
干枯组织处理：如组织已干枯，应在以上程序后水化，放 1%~2% 冰醋酸内使组织软化后重新水洗，水洗时间视标本大小确定。
重新固定：把经过各级乙醇浸泡得组织重新放入 70% 甲醛乙醇溶液中固定。
后续处理：把经过二次处理的组织和下一批标本一起放入脱水机内常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片。
2. 特殊组织固定建议
骨组织固定：非特殊需要，不要使用酸性固定剂，防止骨组织加速膨胀破坏结构。
淋巴结固定：取材厚度为 0.2cm 的组织块，固定 6 小时后再制片效果更好。
四、其他免疫组化实验问题及解决方法
1. 内源性过氧化物酶的灭活
一般 3% 过氧化氢灭活时间短点，可避光 10 min；0.3% 过氧化氢可适当延长封闭时间，一般 10 - 30 min。
用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或 PBS 好，能更好保护抗原和固定组织，但孵育时间过长易引起脱片。
现用现配，配好后 4oC 避光保存。
2. 抗原修复的条件选择
大多数甲醛固定的组织在开始染色前要先修复抗原，常用热修复法和酶解法。
推荐两种常用热修复缓冲液：pH 6.0，10mM 柠檬酸盐缓冲液和 pH 9.0，0.5mM Tris - EDTA 缓冲液，具体参考抗体说明书选择。
微波加热修复为实验室常用修复方法。
3. 封闭血清的选择原则
切片空余地方会非特异性吸附抗体造成假阳性，需封闭后进行一抗孵育。
封闭血清一般和二抗同一来源，可预先结合组织中有交叉反应的位点。封闭血清的选择原则致力于为分析测试行业奉献终身。膜上或切片上有剩余的位点可以非特异性吸附抗体，造成后续结果的假阳性。封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合，会造成背景。也可用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。
羊血清在免疫组化中的作用主要是封闭，目的是为了减少非特异染色。免疫组化中用血清封闭的较多。封闭血清一般选择和二抗同一来源的（如一抗为兔来源多抗，二抗为山羊抗兔 IgG，那封闭液就用山羊血清），血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，注意封闭用血清中不能含有目标蛋白，且与一抗来源不同。另外二抗因尽量少选取兔子或老鼠来源的，因为这两个在亲缘关系上和人类非常接近，所以产生交叉反应的机会就比较大，从而导致背景比较高。适合选用来源于驴，山羊，绵羊等的二抗，背景相对就很低。
4. 抗体孵育条件
一抗孵育温度有 4oC、室温、37oC，其中 4oC 过夜效果最佳。孵育时间与温度、抗体浓度有关，一般 37oC 1 - 2 h，4oC 过夜。
DAB 显色时间由显微镜下控制，到出现浅棕色本底时即可冲洗，显色时间长短可反映抗体浓度、封闭时间等问题。
5. 免疫组化实验遇到的其他问题及解决方法
石蜡切片染色脱片问题及解决办法，如延长烤片时间和提高温度、用含多聚赖氨酸玻片等。
边缘效应问题及解决办法，如制备优质胶片、试剂充分覆盖组织等。
产生组织切片非特异性染色问题及解决办法，如缩短抗体孵育时间、稀释抗体等。一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看；内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；DAB 孵育时间过长或浓度过高；PBS 冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗、二抗或 SP 孵育之后的浸洗尤为重要；标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。
免疫组化染色呈阴性结果问题及解决办法，如检查抗体浓度和质量、充分抗原修复等。抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误；抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合；建议微波修复用高火 4 次 * 6min 试试。若不行，还可高压修复；组织切片本身这种抗原含量低；血清封闭时间过长；DAB 孵育时间过短；细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应；开始做免疫组化，一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方法问题。
背景问题及解决办法，如调整一抗浓度、DAB 孵育时间、血清封闭时间等。考虑一抗浓度高；然后调整 DAB 孵育时间；也要考虑血清封闭时间是否过短；适当增加抗体孵育后的浸洗次数和延长浸洗时间等。
五、总结
组织固定在动物免疫组化实验中占据着至关重要的地位。良好的组织固定能够确保实验结果的准确性和可靠性，而固定不良则可能引发一系列严重后果，极大地增加实验失败的风险。
当组织固定出现问题时，我们可以采取一系列补救措施。例如，对于固定不良的组织，可以通过融蜡除蜡、二甲苯脱蜡、乙醇逐级浸泡、处理干枯组织以及重新固定等步骤进行补救。同时，对于特殊组织如骨组织和淋巴结，也有相应的固定建议。
此外，在免疫组化实验中还可能遇到其他问题，如内源性过氧化物酶的灭活、抗原修复的条件选择、封闭血清的选择、抗体孵育条件等问题，我们也分别给出了相应的解决方法。对于免疫组化实验遇到的其他问题，如石蜡切片染色脱片、边缘效应、组织切片非特异性染色、免疫组化染色呈阴性结果以及背景问题等，也提供了具体的解决办法。
总之，科研人员在进行动物免疫组化实验时，应严格控制实验条件，尤其是组织固定环节。一旦出现问题，要及时采取有效的补救措施，以确保实验的顺利进行。同时，不断积累经验，提高实验技能，为动物免疫组化实验的成功提供有力保障。
