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干眼症小鼠模型概述
干眼症疾病简述
干眼症又称干燥性角膜结膜炎，是指各种原因引起的泪液质和量异常或动力学异常，导致泪膜稳定性下降，并伴有眼部不适，引起眼表组织病变为特征的多种疾病的总称。其发病机制较为复杂，主要涉及以下几个方面：一是眼泪分泌减少，眼泪作为眼睛最重要的保护因素之一，当其分泌量不足或质量下降时，眼睛就容易出现干眼症；二是眼泪蒸发增加，部分人群眼泪蒸发速率高于正常人，致使眼睛干燥，产生相应症状；三是眼泪成分改变，眼泪包含水、蛋白质、油脂等多种成分，一旦这些成分发生变化，也容易引发干眼症；四是眼表组织受损，像结膜、泪膜等眼表组织受到伤害时，会影响眼泪的正常分泌和稳定，进而导致干眼症；此外，长期处于空调房间、干燥环境等环境因素，同样会增加干眼症的发病几率。
从全球范围来看，干眼症目前的发病率大概在 5.5%—33.7% 左右，且存在女性高于男性、老年人高于青年人、亚洲人高于其他人种的特点。比如美国在 65—84 岁的人群中，有 14.6%（约 430 万人口）患干眼，日本为 17%，澳大利亚为 10.3%，中国为 21%，而我国部分地区基于卫生条件和环境状态等因素影响，发病率可能还会更高。干眼症对患者的生活质量和视力健康有着不容忽视的影响，由于缺少足够的泪液保护眼球，会使眼球表面的角膜干燥和受损，直接影响视力，还容易让患者感到眼干、疼痛、灼热、刺痛等不适，造成眼疲劳，影响正常的生产生活。而且角膜干燥后，表面易受细菌和病毒感染，引发角膜炎等眼病，进一步损害视力。长期遭受眼部不适和视力问题困扰，还会使患者产生沮丧、焦虑等负面情绪，甚至对全身健康也会产生影响，比如出现免疫力下降、头痛、喉咙痛、肌肉酸痛、手脚发凉、皮肤干燥等症状。
鉴于干眼症是一种复杂且影响较大的慢性疾病，多需长期治疗，而要深入研究其发病机制、探索有效的治疗方法等，建立合适的动物模型就显得尤为重要，它能够为后续的科研及临床应用提供有力的依据与支撑。
干眼症小鼠模型建立方法
常用动物模型种类对比
在干眼症研究中，常用的动物模型包括小鼠、大鼠、兔、狗等，它们各自有着不同的特点、优缺点以及适用范围。
小鼠模型是干眼症研究中较为常用的一种。其具有诸多优势，首先，小鼠繁殖速度快，能在相对较短时间内获得足够数量的实验样本，这对于需要大量样本数据支撑的研究来说十分有利；其次，小鼠的基因型多样，方便通过基因改造等手段来模拟人类干眼症的基因突变情况，有助于深入探究相关基因在干眼症发病机制中的作用；再者，小鼠免疫系统发育完善，可用于研究免疫相关干眼症；而且，它还适用于各种干眼症治疗方法的效果评估，操作起来相对便捷。不过，小鼠的眼部结构和生理特征与人类毕竟存在一定差异，在某些方面可能无法完全精准地模拟人类干眼症的所有情况。
大鼠模型同样可用于干眼症研究。相较于小鼠，大鼠的眼睛更大，更便于观察和进行实验操作，比如在需要直接观察眼部细微变化或者进行一些较为精细的眼部检测时，大鼠会更具优势。它可用于长时间干眼症病程模拟，对于研究干眼症的病程发展变化有重要意义，也适用于药物筛选和治疗方法评估，还能用来研究神经调控对干眼症的影响，但大鼠的饲养管理等方面相对要求更高一些，成本也会有所增加。
兔模型也是常用选择之一，兔眼具有与人类相似的眼球结构和生理特点，所以常用于模拟泪液分泌不足的干眼症，并且在研究角膜表面的病理改变方面能提供很好的参考，还可用于评估人工泪液等治疗方法的效果。然而，兔子的个体差异相对较大，在实验标准化方面可能需要更多的考量和控制措施。
狗模型同样可应用于干眼症研究，其眼睛较大，泪液分泌量适中，可用于模拟泪液蒸发过快的干眼症，也适用于研究干眼症对视觉功能的影响以及评估长期治疗效果，但狗的饲养成本较高，来源相对没有小鼠等那么广泛，而且实验操作难度相对偏大。
综合来看，虽然各类动物模型都有其自身特点，但小鼠模型凭借繁殖快、基因型易改造、操作方便等优势，在众多干眼症相关研究中应用更为广泛。
药物诱导模型方法
下面详细介绍伴刀豆球蛋白 A 诱导的小鼠干眼症模型的构建方法。
首先是试剂与耗材的准备，需要用到刀豆球蛋白 A（可选用源叶生物等可靠来源的产品）、PBS 缓冲溶液、一次性胰岛素注射针、100μl 移液器（含吸头）、酚红棉线以及 3％lissamine green b 染色剂等。
接着是溶液的配制，要配制浓度为 10mg/ml 至 15mg/ml 的刀豆球蛋白 A PBS 溶液，配制完成后，将其分装为 20±2μl / 滴。在使用时，用胰岛素注射针吸取一滴配制好的溶液，注射到小鼠一侧泪腺即可，这里所选用的小鼠通常为成年 balb/c 小鼠。该方法的实验原理在于，刀豆球蛋白 A 可以导致泪腺炎症的发生，引起 MMP-9 及细胞因子 IL-8 水平的升高，同时造成泪腺萎缩和泪液减少。
此外，该模型构建方法还包括造模后第三天进行模型验证。模型验证有多种方法，一是在全身麻醉和无局部麻醉状态下利用酚红棉线对小鼠泪液分泌量进行检测，若酚红棉线染色长度达 5mm 则认为小鼠泪液分泌正常，染色长度为 2mm 则认为小鼠泪液分泌不足，即造模成功；二是采用 3％lissamine green b 染色剂对小鼠进行滴眼，持续 1min 后，用纱布吸去多余染液，此后在显微镜下观察小鼠角膜染色情况，正常小鼠眼球不着色，成模小鼠角膜会染为蓝色；三是使用 RT-PCR 对小鼠泪腺 RNA 进行检测，泪腺萎缩后 RNA 含量将降低，体现在 RT-PCR 目的扩增片段 CT 值增加。通过这些不同角度的验证方法，可以较为全面准确地判断所构建的干眼症小鼠模型是否符合要求，为后续的研究，比如用于治疗干眼症的药物研发等提供可靠的模型基础。
模型验证流程
不同验证方法介绍
在构建伴刀豆球蛋白 A 诱导的小鼠干眼症模型后，造模后第三天可采用多种方法对模型进行验证，以下为您详细介绍这些方法及其原理和判断标准。
利用酚红棉线检测泪液分泌量
原理：酚红棉线可通过与泪液接触发生染色反应，其染色长度能够反映泪液的分泌情况。正常情况下，小鼠泪液分泌量能使酚红棉线达到一定的染色长度，而在干眼症模型中，由于泪液分泌减少，染色长度会相应变短。
操作及判断标准：在全身麻醉和无局部麻醉状态下，将酚红棉线放置在小鼠眼部相应位置，待其与泪液充分接触后观察染色长度。若酚红棉线染色长度达 5mm 则认为小鼠泪液分泌正常，当染色长度为 2mm 时，则表明小鼠泪液分泌不足，也就意味着造模成功。
采用 3％lissamine green b 染色剂观察角膜染色情况
原理：3％lissamine green b 染色剂对角膜上皮细胞具有特殊的亲和性，正常角膜上皮完整的情况下，染色剂不易着色，而在干眼症导致角膜上皮出现损伤等改变时，染色剂能够附着并显色，以此来判断角膜的状态变化，进而验证模型是否构建成功。
操作及判断标准：用移液器吸取适量的 3％lissamine green b 染色剂，对小鼠进行滴眼，让染色剂在眼内停留持续 1min，随后使用纱布轻轻吸去多余染液，再将小鼠置于显微镜下观察角膜染色情况。正常小鼠的眼球不会着色，呈现原本的状态；而成模的小鼠角膜会染为蓝色，说明角膜已经出现了符合干眼症特征的改变。
使用 RT-PCR 对小鼠泪腺 RNA 进行检测
原理：泪腺萎缩是干眼症的一个重要病理特征，当泪腺发生萎缩后，其细胞内的 RNA 含量会出现变化。RT-PCR（逆转录 - 聚合酶链反应）技术可以对泪腺组织中的 RNA 进行扩增和检测，通过分析特定 RNA 的含量变化，也就是观察目的扩增片段 CT 值的变化情况，来判断泪腺的状态。一般来说，泪腺萎缩后 RNA 含量降低，相应地在 RT-PCR 检测中目的扩增片段 CT 值会增加。
操作及判断标准：首先要提取小鼠泪腺组织中的 RNA，这个过程需要严格按照 RNA 提取试剂盒的操作流程进行，避免 RNA 被降解等情况发生，保证所提取 RNA 的质量和完整性。提取完成后，配置好 RT-PCR 反应体系，加入相应的引物（引物需根据检测的目标 RNA 序列进行特异性设计）、逆转录酶、DNA 聚合酶、dNTP 等试剂，然后将反应体系放入 PCR 仪器中，按照设定好的程序进行反应，包括变性、退火、延伸等步骤的循环。反应结束后，分析得到的扩增曲线及 CT 值数据，若发现目的扩增片段 CT 值相较于正常小鼠有所增加，就表明泪腺出现了萎缩情况，符合干眼症模型的特征，进而判断模型构建成功。
通过上述不同角度、不同原理的模型验证方法，可以较为全面、准确地对所构建的干眼症小鼠模型进行评估，为后续围绕干眼症开展的各项研究，例如探究发病机制、研发治疗干眼症的药物等工作，提供可靠且符合要求的动物模型基础。
模型应用领域
在药物研发中的应用
构建好的干眼症小鼠模型在治疗干眼症药物的研发中有着至关重要的应用。首先，需要对实验小鼠进行合理分组，通常会分为模型组、正常对照组、阳性药物组和阴性药物组等。
模型组的小鼠就是通过上述构建方法成功建立干眼症模型的个体，它们能够呈现出干眼症的相关症状与病理特征，用于对比观察后续治疗的效果。正常对照组则选取健康的、未经过造模处理的小鼠，以此来体现正常状态下小鼠眼部各项生理指标的情况，为判断造模是否成功以及药物治疗效果提供参照标准。阳性药物组会使用目前临床上已经被证实对干眼症有确切疗效的药物来进行治疗，例如像人工泪液、环孢素滴眼液等常用药物，通过对比该组与模型组的情况，能够验证实验体系的可靠性以及为新药物疗效评估提供对比依据。阴性药物组一般给予的是对干眼症无治疗作用的安慰剂或者溶剂等，同样用于对照观察新药物是否能产生实质性的治疗效果。
分组完成后，便开始执行相应的治疗方案。比如针对新研发的某种眼药水，按照设定好的剂量和频次，分别给不同组别的小鼠滴眼给药，整个治疗周期会持续一定的时间，时间长短根据药物的特性以及实验设计需求来确定。
待治疗方案周期结束后，就需要通过包括病理、生化检测在内的一系列相关检测来确认治疗药物是否有效。在病理检测方面，可以对小鼠的眼表组织、泪腺等进行切片观察，查看眼表上皮细胞的完整性、是否存在炎症细胞浸润、泪腺细胞的形态及数量变化等情况。若新药物治疗有效的话，在显微镜下可以看到眼表上皮趋于完整、炎症反应减轻、泪腺萎缩情况得到改善等表现。
生化检测也是重要的评估手段，例如检测泪液中一些特定蛋白质、细胞因子的含量变化，像泪液中黏蛋白的含量、炎症因子如白细胞介素 - 6（IL - 6）、肿瘤坏死因子 - α（TNF - α）等的水平。有效的药物往往能够使泪液成分更趋近于正常状态，减少炎症因子的表达，促进黏蛋白等保护性成分的正常分泌。还可以检测泪腺组织中相关基因的表达情况，运用如实时荧光定量 PCR（RT - PCR）等技术，观察与泪液分泌、眼表保护相关基因的表达是否上调等，从分子层面来验证药物对干眼症的治疗作用。
例如，在利用 AQP5 基因敲除小鼠（AQP5 - /- ）模型筛选或评价干眼治疗药物的效果时，由于该模型出生后即出现泪液分泌减少等特征性改变，且模型稳定。当给予不同药物干预后，通过检测泪腺组织中 AQP5 基因相关上下游调控基因的表达变化，以及观察泪液分泌量等指标，就能判断药物是否能对因 AQP5 基因缺失导致的干眼症起到改善作用。
再比如，在研究雷帕霉素纳米滴眼液和眼膏治疗小鼠干眼症的实验中，把小鼠分为对照组（PBS 组）、雷帕霉素眼膏组、雷帕霉素纳米滴眼液组、替巴康治疗组等不同组别，经过一定周期的治疗后，从小鼠角膜、结膜组织和泪腺中采集细胞，观察核浆比、细胞凋亡率以及 Bax / Bcl - 2 比值变化的情况，结果发现雷帕霉素纳米滴眼液和眼膏均能显著减轻小鼠角膜和结膜的炎症和细胞凋亡率，并显著提高泪液分泌功能，从而验证了这两种药物剂型在干眼症治疗中的有效性。
总之，干眼症小鼠模型为药物研发搭建了良好的实验平台，能够帮助科研人员筛选出更有潜力、更有效的干眼症治疗药物，推动干眼症治疗领域不断向前发展。
优势总结
伴刀豆球蛋白 A 诱导模型优点
伴刀豆球蛋白 A 诱导的小鼠干眼症模型相较于传统方法有着诸多优势。
其一，在实验动物的选择上，使用的是普通 balb/c 小鼠，这种小鼠来源相对广泛，价格比较低廉，能在一定程度上降低实验成本。而且其成模率可达 70％以上，较高的成模率意味着可以更高效地获得符合要求的干眼症小鼠模型，为后续研究提供充足的样本基础，减少因成模失败导致的反复实验等情况出现。
其二，从造模的操作过程来看，本方法为单次注射方法。相较于传统的多次长时间诱导的方式，单次注射极大地降低了药物的使用率，避免了因多次用药可能带来的实验变量不好控制等问题。同时，造模周期也明显缩短，能够更快地构建出干眼症小鼠模型，加快整个科研项目的进度，让研究人员可以更及时地开展后续诸如药物研发等相关工作。
其三，从模型的特征角度而言，此方法诱导出的干眼症模型，会出现泪腺萎缩、泪腺炎症等病理特征，这些特征与干眼症在临床上所呈现出的部分特征相符合。这使得该模型能够更好地模拟人类干眼症的实际病理状态，为深入探究干眼症的发病机制以及研发针对性治疗药物等，提供更贴合实际情况的研究载体。
总之，伴刀豆球蛋白 A 诱导的小鼠干眼症模型凭借这些优势，在干眼症相关研究尤其是治疗干眼症药物的研发等。
