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引言
蛋白质是生命活动的主要承担者，在细胞的结构和功能中起着至关重要的作用。对蛋白质进行纯化是研究其结构、功能、相互作用等的基础。随着生物技术的不断发展，蛋白纯化技术也日益丰富和完善。不同的纯化方法基于蛋白质的不同性质，如分子大小、电荷、亲和力等。以下将详细介绍几种常用的蛋白纯化方法及其原理。
一、根据分子大小的纯化方法
（一）透析和超滤
原理
透析是利用半透膜的原理，半透膜具有一定的孔径，只允许小分子物质（如盐、缓冲液分子等）自由通过，而大分子蛋白质则被截留在膜内。通过不断更换透析外液，可以将蛋白质溶液中的小分子杂质去除，达到初步纯化和更换缓冲液的目的。
超滤则是在压力驱动下，使蛋白质溶液通过具有特定截留分子量的超滤膜。小于截留分子量的小分子物质随溶剂一起透过膜，而大于截留分子量的蛋白质则被保留在膜上，从而实现蛋白质的浓缩和分离。
应用场景
透析常用于蛋白质样品的脱盐、缓冲液置换等预处理步骤。超滤则更适用于蛋白质的浓缩和粗分级，例如在蛋白质提取后，去除大量的小分子杂质并将蛋白质浓缩到合适的浓度。
（二）凝胶过滤层析（分子筛层析）
原理
凝胶过滤层析的固定相是具有一定孔径大小的多孔凝胶颗粒。当蛋白质混合溶液通过凝胶柱时，不同大小的蛋白质分子在凝胶颗粒内部和外部的分布情况不同。大分子蛋白质不能进入凝胶颗粒内部，只能沿着凝胶颗粒之间的空隙向下移动，因此其流程较短，先流出层析柱；而小分子蛋白质可以进入凝胶颗粒内部，在凝胶孔道中扩散，其流程较长，后流出层析柱。这样，根据蛋白质分子大小的不同，实现了蛋白质的分离。
应用场景
凝胶过滤层析常用于蛋白质的分级分离、去除聚合体和测定蛋白质的分子量。例如，在重组蛋白表达后，可能存在单体、二聚体甚至多聚体的形式，通过凝胶过滤层析可以将它们分离，得到单一形式的蛋白质。
二、根据电荷性质的纯化方法
（一）离子交换层析
原理
离子交换层析的固定相是带有电荷基团的离子交换剂。根据离子交换剂所带电荷的不同，可分为阳离子交换剂（带负电荷）和阴离子交换剂（带正电荷）。蛋白质是两性电解质，在不同的 pH 条件下会带有不同的电荷。当蛋白质溶液通过离子交换柱时，带相反电荷的蛋白质会与离子交换剂结合，而带相同电荷的蛋白质则直接流出。通过改变洗脱液的 pH 或离子强度，可以使结合在离子交换剂上的蛋白质依次被洗脱下来，从而实现蛋白质的分离。
例如，在阳离子交换层析中，当溶液 pH 低于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电荷，会与带负电荷的阳离子交换剂结合；然后通过逐渐增加洗脱液的离子强度或改变 pH，使蛋白质与离子交换剂之间的结合力减弱，从而将蛋白质洗脱下来。
应用场景
离子交换层析是一种非常常用的蛋白纯化方法，可用于蛋白质的粗分离和精细纯化。它可以根据蛋白质电荷的微小差异进行分离，对于含有多种蛋白质的复杂样品有很好的分离效果。常用于从细胞裂解液中初步分离目标蛋白。
（二）等电聚焦电泳
原理
等电聚焦电泳是在电场中建立一个 pH 梯度，蛋白质分子在电场中会向与其等电点（pI）相等的 pH 位置移动。当蛋白质到达其等电点位置时，净电荷为零，不再移动，从而在 pH 梯度中聚焦形成一条狭窄的区带。不同等电点的蛋白质会聚焦在不同的位置，从而实现蛋白质的分离。
应用场景
等电聚焦电泳主要用于测定蛋白质的等电点，也可用于蛋白质的分离和纯度检测。例如，在研究蛋白质的翻译后修饰时，由于修饰可能会改变蛋白质的等电点，通过等电聚焦电泳可以检测到修饰后的蛋白质与未修饰蛋白质的差异。
三、根据亲和力的纯化方法
（一）亲和层析
原理
亲和层析是利用蛋白质与特定配体之间的特异性亲和力进行分离的方法。固定相是将具有特异性亲和力的配体共价连接到固相载体上制成的亲和吸附剂。当含有目标蛋白质的混合溶液通过亲和层析柱时，目标蛋白质会与配体特异性结合，而其他杂质则不结合或结合较弱，直接流出层析柱。然后通过改变洗脱条件（如改变 pH、离子强度、添加竞争配体等），使目标蛋白质与配体的结合力减弱，从而将目标蛋白质从亲和吸附剂上洗脱下来，得到纯化的蛋白质。
常见的配体包括抗体、抗原、酶的底物或抑制剂、辅酶等。例如，在纯化重组融合蛋白时，常常利用融合标签（如 His - tag、GST - tag 等）与相应的配体（如镍离子、谷胱甘肽等）之间的亲和力进行纯化。
应用场景
亲和层析具有很高的特异性和选择性，能够一步实现目标蛋白质的高度纯化。常用于从复杂的生物样品中快速、高效地分离目标蛋白质，是蛋白质纯化中最常用的方法之一。
（二）免疫亲和层析
原理
免疫亲和层析是亲和层析的一种特殊形式，它利用抗原与抗体之间的特异性免疫反应进行蛋白质的分离。将特异性抗体共价连接到固相载体上制成免疫吸附剂。当含有目标抗原（蛋白质）的样品通过免疫亲和层析柱时，目标抗原会与抗体特异性结合，而其他杂质则被洗脱除去。然后通过适当的洗脱条件（如低 pH 缓冲液、高离子强度缓冲液等），使抗原 - 抗体复合物解离，将目标抗原洗脱下来。
应用场景
免疫亲和层析主要用于纯化具有抗原性的蛋白质，尤其是那些含量较低、难以用其他方法纯化的蛋白质。在生物制药领域，常用于单克隆抗体的纯化以及重组蛋白的质量控制。
四、根据疏水性的纯化方法
疏水相互作用层析
原理
疏水相互作用层析的固定相是表面键合有疏水基团（如烷基、芳基等）的疏水吸附剂。蛋白质表面存在一些疏水区域，在高盐浓度下，蛋白质的疏水区域会暴露出来，并与固定相上的疏水基团发生疏水相互作用而结合。当逐渐降低洗脱液的盐浓度时，蛋白质与固定相之间的疏水相互作用减弱，蛋白质依次被洗脱下来。不同蛋白质的疏水性不同，其与固定相的结合强度也不同，从而实现蛋白质的分离。
应用场景
疏水相互作用层析常用于蛋白质的中度纯化和精细纯化，尤其适用于那些在离子交换层析或亲和层析后仍有杂质的蛋白质样品的进一步纯化。它可以与其他纯化方法联合使用，提高蛋白质的纯化效果。
五、其他纯化方法
电泳纯化
原理
电泳是利用带电粒子在电场中向与其所带电荷相反的电极移动的原理进行分离的方法。常见的蛋白质电泳方法有 SDS - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS - PAGE）和聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）等。SDS - PAGE 是在聚丙烯酰胺凝胶中加入十二烷基硫酸钠（SDS），SDS 能够与蛋白质结合，使蛋白质带上均匀的负电荷，从而消除了蛋白质分子的电荷差异，此时蛋白质在电场中的迁移速度主要取决于其分子量大小。通过电泳可以将不同分子量的蛋白质分离成不同的条带，然后通过切割凝胶条带、洗脱等方法可以得到纯化的蛋白质。
应用场景
电泳纯化主要用于蛋白质的分析和少量蛋白质的制备。例如，在蛋白质纯度检测中，SDS - PAGE 可以直观地显示蛋白质样品中是否存在杂质；在一些蛋白质晶体学研究中，需要制备高纯度的蛋白质样品，电泳纯化可以作为一种辅助手段来进一步提高蛋白质的纯度。
六、蛋白纯化方法的选择与组合
在实际的蛋白纯化过程中，很少使用单一的纯化方法，通常需要根据蛋白质的来源、性质、纯度要求等因素选择合适的纯化方法并进行组合。一般来说，首先采用一些粗分离方法（如透析、离子交换层析等）去除大量的杂质，然后再用精细纯化方法（如亲和层析、凝胶过滤层析等）进一步提高蛋白质的纯度。例如，对于重组蛋白的纯化，常常先通过亲和层析利用融合标签进行快速富集，然后再用凝胶过滤层析去除可能存在的聚合体和其他杂质，得到高纯度的单体蛋白质。
七、结论
蛋白纯化是一个复杂的过程，不同的纯化方法基于蛋白质的不同性质，各有其优缺点和适用范围。随着生物技术的不断发展，新的纯化方法和技术也在不断涌现。在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的纯化方法并进行优化组合，以达到高效、快速、高纯度地纯化蛋白质的目的。同时，蛋白纯化技术的发展也将为蛋白质结构与功能的研究、生物制药等领域的发展提供有力的支持。
