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一、qPCR 检测结果不稳定的现象
qPCR 每次检测结果都不一样，这让许多科研工作者感到困惑。在进行 qPCR 实验时，常常会出现结果不稳定的现象。例如，复孔间的 CT 值可能存在较大差异。当 Ct≥30 时，复孔的重复性差属于正常现象，因为在模板量很少的情况下，模板与引物的碰撞存在随机性，直接导致复孔之间的 Ct 值差异较大。此时，如果溶解曲线呈单峰，且 NTC 与目的基因孔的 Ct 差异在 3 以上，说明实验是准确的。实验时可以加大复孔的数量，选择差异较小的进行数据分析即可。而当 Ct<30 时，复孔差异较大一般为实验操作问题导致。解决方法包括将模板稀释后上样、准确配置 qPCR 反应体系并充分混匀，以及定期校准 qPCR 仪器。
此外，NTC（无模板阴性对照）也可能出现 Ct 值。如果 NTC 与目的基因孔的融解曲线峰不重叠，一般是因为引物二聚体造成，无需处理，并不影响目的基因 Ct 值的准确度。但若 NTC 与目的基因孔的融解曲线峰重叠，可能是反应孔被污染，一般为气溶胶污染。此时可以计算目的基因的 Ct 值与 NTC 的 Ct 值的差值（△Ct）来判定。若 △CT ≥5，说明气溶胶带来的污染对体系影响非常小，可以忽略不计；如果达不到 △Ct≥5 的程度，△Ct≥3 也可以认为气溶胶的污染程度很低，目的基因的 Ct 值可正常使用；若△Ct＜3，说明污染已经很严重，目的基因的 Ct 值是不能使用的。
Ct 值较大也可能是多种原因导致的。如果相同体系前期实验 Ct 值正常，本次实验所有基因扩增 Ct 值皆偏大，可能是 RNA 存在降解。可通过 1 - 2%琼脂糖凝胶电泳对 RNA 质量进行检测，降解严重的样品应重新提取 RNA，优化提取过程。一般情况下 Ct≥35 数据可信度较低，所以最好保持 Ct 在 34 以下最好。如果该基因第一次扩增，其 Ct 值偏大，而其余基因的 Ct 值正常，可能是基因的扩增效率降低或基因本身的转录水平低导致的 Ct 偏大。可将基因的扩增产物进行梯度稀释，同时进行 qPCR，将得到的标准曲线进行引物扩增效率的计算。通过标准曲线可以得到线性方程，将线性方程得到的斜率 (K) 带入扩增效率计算公式中：e = 10[-1/k]-1。只有当扩增效率满足 90~120%，且标准曲线 R2 ≥ 0.99，引物的扩增效率才是合格的，定量出来的 Ct 值才可以用来计算，且扩增效率越接近 100%，引物的扩增性能越优。若判断为扩增效率较低，主要为反应条件不适宜或者引物设计不合理，应重新优化反应体系或者引物设计。基因本身的转录水平低可以适当提高上样模板的量以降低 Ct 值在合理的范围之内。
另外，qPCR 实验还可能出现没有荧光信号的情况。可能原因及解决方法包括：没有信号采集步骤，每个扩增循环结束后，应设置收集步骤；体系蒸发，可用专用的高质量 8 联排管盖或用封膜仪封板；没有扩增，可通过 2%琼脂糖凝胶电泳对 qPCR 产物进行跑胶检测（120v,20min 左右），看是否有条带。如果没有条带或者条带弥散，可能是引物或模板有问题，也可能是基因表达量太低；模板浓度太低，如果内参没有有信号或内参 CT 值大于 25，说明浓度太低。或者模板存在 PCR 抑制剂，建议重新制样后再检测。
二、原因分析
（一）操作问题
移液枪使用不当长期快速操作微量移液枪易导致大拇指关节受损，进而影响移液量。吸取液体时应插入凹液面底部，避免侧面产生气泡，减少加样误差。同时加模板时可提高加样量。
加样不准确cDNA 未混匀、加样量不准、枪头沾有小液珠、加到侧壁等问题都可能导致加样量不准确。
枪头松动加样时枪头掉下来会使加样量不准。
（二）RNA 降解
RNA 的完整性体现在电泳过程中 18S 和 28S 的亮度上，若亮度变低甚至没有，说明 RNA 完整性有损失。可能由镁离子、pH、温度、紫外线、福尔马林等因素造成。短片段比长片段扩增效率更高，所以引物设计时应尽量把片段设计得短一点。根据参考资料中的“RNA降解对于qPCR实验的影响到底有多大?(附影响结果)- 丁香通”可知，RNA 降解程度可根据 RIN 值来评定，RIN 值越接近 10，RNA 完整性越好；RIN 值越接近 1，RNA 降解越严重。当 RNA 降解时，不论是高丰度表达基因还是低丰度表达基因，RNA 降解程度越高，Ct 值越大；RNA 完整性越好，Ct 值越小。同时，RNA 质量越好，Ct 值波动越小，qPCR 实验的重复性也越好。即使使用内参基因校正，RNA 模板发生降解依旧会造成定量结果出现误差，不能精确反应样本间的基因表达量的差异。但当降解不严重时，还是可以用于基因的定性分析。
（三）存在抑制物
反转录和 PCR 过程中可能存在抑制物，如 Na 离子、EDTA、SDS、酚、血红素、腐植酸等，会对 qPCR 结果产生影响。去除抑制剂只能在抽提过程中尽量洗脱掉，其他操作过程较难处理。参考资料“qPCR实验的重要影响因素--抑制剂-艾普拜生物科技(苏州)有限公司”提到，可以通过连续稀释样品来评估样品的 PCR 效率，判断是否是由于抑制剂引起的扩增效率异常。当原液的数据点位于标曲上方，则极有可能是样本抑制剂抑制 PCR 反应导致 Cq 值偏大。同时，还介绍了检测抑制剂的方法，如内部扩增控制（IACs）和使用外源性对照（Spikes）等，以及降低抑制剂影响的方法，如对模板进行稀释、进一步纯化或改进提取方法等。
（四）其他因素
ROX 浓度和机型不匹配ROX 是一种惰性参比染料，能通过均一化校正消除 qPCR 反应中物理因素造成的误差，提高数据精确性。若 ROX 浓度和机型不匹配，可调整 ROX 浓度或在仪器上将参比染料设置为 NONE。参考资料“qPCR 每次结果都不太一样？！究竟为哪般？|163-手机网易网”详细介绍了 ROX 的作用，在 qPCR 反应中有许多反应本身的物理因素会影响信号检测，从而造成孔间数据的差异，而 ROX 能帮助我们通过均一化校正消除这些因素的误差，从而提高数据精确性。
CT 值异常复孔间 CT 差异大可能是模板量少、实验操作问题等导致。NTC 出现 Ct 值可能是引物二聚体或反应孔被污染。Ct 值较大可能是 RNA 降解、基因扩增效率低或转录水平低。没有荧光信号可能是未设置信号采集步骤、体系蒸发、没有扩增或模板浓度太低。
扩增曲线问题扩增曲线无法达到平台期可能是基因丰度较低。平台期下降可能是模板量过高及基线设置不当。平台期锯齿状可能是 RNA 纯度低或仪器需要校准。扩增曲线杂乱无规律可能是 ROX 浓度问题。有溶解曲线无扩增曲线可能是反应程序问题。反应结束无扩增曲线出现可能是反应循环数不够、未设置采集荧光信号步骤或模板量太低。复孔的扩增曲线平台期不一致可能是加样不准确。溶解曲线有双峰可能是 gDNA 污染、引物特异性不好或有引物二聚体。这些问题在参考资料中均有不同程度的提及，如“qPCR结果异常原因分析及解决方案-手机网易网”对 CT 值异常和扩增曲线问题进行了详细分析，并给出了相应的解决方法；“qPCR常见问题及解决方案_企业动态-丁香通”针对扩增曲线异常和熔解曲线异常的各种情况提供了具体的解决方案。
三、解决方案
1. 规范操作
正确使用移液枪，保持 1 - 2 秒给弹簧缓冲，提高模板加样量：做生物实验外包前，在进行 qPCR 实验时，正确使用移液枪至关重要。长期快速操作微量移液枪易导致大拇指关节受损，进而影响移液量。吸取液体时应插入凹液面底部，避免侧面产生气泡，减少加样误差。同时加模板时可提高加样量，并在加样后保持 1 - 2 秒给弹簧缓冲，确保加样的准确性。
确保准确加样，提前配制好预混液，扩大反应体系：cDNA 未混匀、加样量不准、枪头沾有小液珠、加到侧壁等问题都可能导致加样量不准确，枪头松动加样时枪头掉下来也会使加样量不准。为确保准确加样，可提前配制好预混液，减少人为操作误差。同时，扩大反应体系可以提高实验的准确性和重复性。
保持实验室卫生整洁，定期校准保养仪器：保持实验室卫生整洁可以减少污染的风险。定期校准保养仪器可以确保仪器的准确性和稳定性，减少因仪器问题导致的实验误差。
2. 防止 RNA 降解
注意影响 RNA 完整性的因素，如镁离子、pH、温度等：RNA 的完整性体现在电泳过程中 18S 和 28S 的亮度上，若亮度变低甚至没有，说明 RNA 完整性有损失。可能由镁离子、pH、温度、紫外线、福尔马林等因素造成。在实验过程中，应注意这些因素，以保持 RNA 的完整性。
设计短片段引物：短片段比长片段扩增效率更高，所以引物设计时应尽量把片段设计得短一点。根据参考资料中的“RNA 降解对于 qPCR 实验的影响到底有多大?(附影响结果)- 丁香通”可知，RNA 降解程度可根据 RIN 值来评定，RIN 值越接近 10，RNA 完整性越好；RIN 值越接近 1，RNA 降解越严重。
3. 处理抑制物
在抽提过程中尽量洗脱掉抑制物：反转录和 PCR 过程中可能存在抑制物，如 Na 离子、EDTA、SDS、酚、血红素、腐植酸等，会对 qPCR 结果产生影响。去除抑制剂只能在抽提过程中尽量洗脱掉，其他操作过程较难处理。参考资料“qPCR 实验的重要影响因素--抑制剂-艾普拜生物科技(苏州)有限公司”提到，可以通过连续稀释样品来评估样品的 PCR 效率，判断是否是由于抑制剂引起的扩增效率异常。
4. 调整 ROX 浓度或设置参比染料
根据机型和实验精度要求调整 ROX 浓度或设置参比染料为 NONE：ROX 是一种惰性参比染料，能通过均一化校正消除 qPCR 反应中物理因素造成的误差，提高数据精确性。若 ROX 浓度和机型不匹配，可调整 ROX 浓度或在仪器上将参比染料设置为 NONE。参考资料“qPCR 每次结果都不太一样？！究竟为哪般？|163 - 手机网易网”详细介绍了 ROX 的作用，在 qPCR 反应中有许多反应本身的物理因素会影响信号检测，从而造成孔间数据的差异，而 ROX 能帮助我们通过均一化校正消除这些因素的误差，从而提高数据精确性。
5. 解决 CT 值异常和扩增曲线问题
根据具体情况采取相应的解决方法，如稀释模板、准确配置反应体系、重新提取 RNA、优化引物设计等：CT 值异常和扩增曲线问题可能由多种原因引起，如模板量少、实验操作问题、RNA 降解、基因扩增效率低或转录水平低、没有荧光信号等。根据具体情况采取相应的解决方法，如稀释模板、准确配置反应体系、重新提取 RNA、优化引物设计等。参考资料中对 CT 值异常和扩增曲线问题进行了详细分析，并给出了相应的解决方法，如“qPCR 结果异常原因分析及解决方案 - 手机网易网”“qPCR 常见问题及解决方案_企业动态 - 丁香通”等。
