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一、免疫组化组织取材
（一）动物标本取材
动物标本取材对于免疫组化实验至关重要。以下是几种常见的动物致死法及取材注意事项。
致死法：
空气栓塞法：适用于大动物，如兔、犬、猫等。向动物静脉内注入一定量的空气，使动物很快死亡。
麻醉法：适用于鼠等小动物，可将浸有乙醚或氯仿的棉球连同动物一起放入密闭容器内进行麻醉，也可用戊巴比妥作静脉注射或氨基甲酸乙酯做腹腔注射。
断头法：适用于小动物，用剪刀剪去动物头部，待血液流出后立即取材。
去头法：用重物猛击头后部或将动物头后部猛撞桌沿。
股动脉放血法：动物麻醉后，切开股动脉放血致死。
取材注意事项：
最好在动物心脏还在跳动时立即取材，并迅速投入环保组织固定液内。脏器的上皮组织易变质，争取在死后半小时内取材完毕，否则免疫组化染色时会产生背景染色。
切取组织使用的刀、剪要求锋利，避免来回挫动组织。因动物组织质脆，夹取组织时切勿用力过重，以免挤压损伤组织。
（二）尸体解剖取材
尸体解剖取材应根据实际需要进行，一般取材部位和数量如下。
一般取材部位和数量：
心和大血管：右心室、左心室、主动脉各一块，取材部位可在距主动脉瓣 5cm 处。
肺：右下叶一块切成正方形，左下叶一块可切成长方形。
肝：右叶一块切成正方形，左叶一块切成长方形。
脾、胰、肾、膀胱、肾上腺、消化道、骨、胸腺、子宫、睾丸或卵巢、脑、脑下垂体等：各取一块或数块。
较严重或复杂病变时：适当增加取材数量，以便彻底检查而作出正确诊断。
（三）活检标本取材
常规活检标本取材：
应注意病变的部位、形状、大小、颜色以及与周围组织的界限，有无完整的包膜。取材时应取病变部位、病变的切缘、病变与正常组织交界处以及远离病灶的正常组织。
取材用的刀剪应锋利，避免挤压组织；组织的切面应平整，组织切忌过大、过厚，否则不仅浪费试剂，而且会造成固定、脱水不良而影响镜下观察。
肾穿刺标本取材：
进行穿刺取得组织后，立即用生理盐水或 PBS 冲洗数次去除血迹，并迅速判断所穿组织是否为肾组织。当确定为肾组织后，立即将组织置于木板上，迅速测量其长度；用解剖显微镜或放大镜进行观察，以区别皮质和髓质，并观察标本是否有肾小球。
穿刺所取得的标本用手术刀片切开，并迅速固定，一半放入装有光镜固定液的青霉素小瓶，另一半放入装有电镜固定液的小瓶，均置于冰瓶保存。
小标本活检取材：
小标本常见为宫颈、宫膜、鼻咽、口腔、喉以及各种窥镜所取得的组织。它们体积较小，因此取材时要用擦镜纸包起来再进行固定、脱水。特别是由胃镜、肠镜等所取的组织，取材时一定要滴上伊红，以防止丢失。
活检组织多用活检钳夹取，常因过度挤压而变形。病灶表面有出血坏死，活检时难于采取到深部组织。因此，活检钳的刀口必须锋利，活检时必须采取主要病灶区，尽量避开坏死区。
二、免疫组化组织固定
（一）固定的目的和重要性
凡需进行病理研究的标本均需进行固定。用于免疫组化研究标本的固定不仅是使细胞的蛋白质凝固，终止或减少外源性和源性细胞分解酶的反应，防止组织细胞自溶，更重要的是保存组织或细胞的抗原性，使抗原不失活，不发生弥散。
（二）固定液的种类
简单固定液和混合固定液。
固定液分为简单固定液和混合固定液。较好的固定液应具有强渗透力，能迅速渗入至组织内部；其次不会使组织发生过度收缩变形，并能使组织内易观察的成分得以凝固为不溶性物质；还要使组织达到一定硬度，有较好的折光率。
较好的固定液应具有强渗透力，能迅速渗入至组织部；其次不会使组织发生过度收缩变形，并能使组织易观察的成分得以凝固为不溶性物质；还要使组织达到一定硬度，有较好的折光率。
（三）固定的方法
浸泡法：将取好的组织直接浸泡在固定液中，固定的时间一般在 2～24h，适用于动物标本、尸检标本及临床活检标本等。
浸泡法是最常用的固定法，将取好的组织直接浸泡在固定液中，固定时间一般在 2～24h，适用于动物标本、尸检标本及临床活检标本等。
蒸气法：比较小而薄的标本可用锇酸或甲醛蒸气固定。主要用于血液、细胞涂片以及某些薄膜组织的固定。
比较小而薄的标本可用锇酸或甲醛蒸气固定。具体方法：在一有盖培养皿内滴入 1％一 2％锇酸水溶液 3 滴，将涂片放入其中，固定 30s 至 1min 左右，立即水洗后进行染色。主要用于血液、细胞涂片以及某些薄膜组织的固定。
注射、灌注固定法：主要适用于动物实验标本的固定。将固定液注入血管，以达到充分的固定。包括局部灌注固定和全身灌注固定。
注射、灌注固定法主要适用于动物实验标本的固定。将固定液注入血管，以达到充分的固定。经血管分支到达整个组织或全身。
（1）局部灌注固定：固定肺组织可将固定液从气管或支气管注入，注入速度不要太快，用力均匀，注入量适当，以免胀破肺泡。固定眼球组织可从眼后房注入固定液。固定肝、肾组织则可从肝、肾动脉注入固定液，同时切断其静脉使得血液排出。脑组织的固定，必须先麻醉动物，分离颈动脉，注射器的针尖向着头部的方向注入固定液。
（2）全身灌注固定：较大的动物往往采取输液方法，将固定液从一侧颈总动脉或股动脉输入，将另一侧相应的静脉切开放血。固定液的输入量因动物而异，兔、猫约 500～1000ml，猴、狗约 1000—2000ml。
微波固定法：经微波固定的组织具有收缩较小、核膜清晰、染色质均匀、分辨清晰等特点，但必须严格控制微波固定的时间和温度。
近几年来微波固定法一直可见报道。经微波固定的组织具有收缩较小、核膜清晰、染色质均匀、分辨清晰等特点，但必须严格控制微波固定的时间和温度。
（四）固定的注意事项
固定液的量：固定组织时，必须有足够的固定液，一般为组织块体积的 10～15 倍。固定用的容器必须足够大，组织材料不要太多，避免组织中的水分渗出而影响固定液的浓度。
固定组织时，必须有足够的固定液，一般为组织块体积的 10～15 倍。固定用的容器必须足够大，组织材料不要太多，避免组织中的水分渗出而影响固定液的浓度。
固定的组织必须新鲜：组织取材后应立即固定，否则，组织易收缩变形，并发生自溶现象。
组织取材后应立即固定，否则，组织易收缩变形，并发生自溶现象。
组织块的体积：组织块的体积宜小而薄，一般用于免疫组化的组织大小宜为 1．OcmXl．OcmX 0．2cm。组织太大，内部得不到充分固定，导致组织结构破坏，给切片带来一定的困难，还增加非特异染色，同时浪费试剂。
组织块的体积宜小而薄，一般用于免疫组化的组织大小宜为 1．OcmXl．OcmX 0．2cm。组织太大，内部得不到充分固定，导致组织结构破坏，给切片带来一定的困难，还增加非特异染色，同时浪费试剂。
组织固定后的冲洗：组织固定后，因固定液渗到组织中，所以必须彻底冲洗，除去固定液，否则会影响下一步的脱水。特别对于长时间固定的标本应用流水冲洗，尽可能削减色素沉着。对于混合固定液固定的组织，更要及时冲洗，否则将影响免疫组化切片的质量。
组织固定后，因固定液渗到组织中，所以必须彻底冲洗，除去固定液，否则会影响下一步的脱水。特别对于长时间固定的标本应用流水冲洗，尽可能削减色素沉着。对于混合固定液固定的组织，更要及时冲洗，否则将影响免疫组化切片的质量。
（五）影响固定的因素
温度：一般固定液固定效果随温度升高而加强，温度一般在 -70～37℃之间，以室温 22℃常用。某些酶的固定要求在 37℃以下进行，而某些病毒的固定则要在低温下进行。对于临床活检标本，固定时间要求短，用中性甲醛在 40℃左右固定 2～3h 即可。
一般固定液固定效果随温度升高而加强，温度一般在 -70～37℃之间，以室温 22℃常用。某些酶的固定要求在 37℃以下进行，而某些病毒的固定则要在低温下进行。对于临床活检标本，固定时间要求短，实践发现用中性甲醛在 40℃左右固定 2～3h 即可。
浓度：10％中性甲醛、4％多聚甲醛最合适，乙醇最常用浓度为 95%。在 37℃或室温固定，适合于许多蛋白质、抗原，并能保持其与抗体的反应能力。70％的乙醇固定能力最强。
10％中性甲醛、4％多聚甲醛最合适，乙醇最常用浓度为 95%。在 37℃或室温固定，适合于许多蛋白质、抗原，并能保持其与抗体的反应能力。70％的乙醇固定能力最强。
固定时间：固定时间要视组织块的大小及固定液的种类、浓度、温度而定。组织块越大，固定时间越长；反之，组织块越小，固定时间越短。固定液的穿透力与浓度成正比，固定的时间与温度成反比。
固定时间要视组织块的大小及固定液的种类、浓度、温度而定。组织块越大，固定时间越长；反之，组织块越小，固定时间越短。固定液的穿透力与浓度成正比，固定的时间与温度成反比。
