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一、引言
细胞计数在细胞培养实验中至关重要，它能够帮助我们准确了解细胞的生长情况，为后续实验提供可靠的数据支持。然而，正确的细胞计数操作并非易事，需要掌握一系列的步骤和技巧。
在生物学、医学及生物技术领域，细胞计数是一项基础且至关重要的实验技术。它不仅为研究人员提供了关于细胞数量、生长状态及功能特性的直接信息，还是评估实验效果、优化实验条件以及疾病诊断与预后评估的关键环节。
细胞计数最关键的步骤是制备均匀的细胞悬液。在细胞培养中，细胞计数是一项基本功，对于刚刚进入实验室开始做细胞实验的我们来说，最让人头疼的就是给细胞计数了，虽然比较简单，但是经常晕头转向、数到眼瞎，而且万一一个不小心被其他人打断了思路，分分钟前功尽弃。其实，之所以觉得数细胞如此辛苦，很大一部分原因是还没有掌握细胞计数的正确操作，当仪器对细胞计数分类出现异常时，手工显微镜检查就显的尤为重要。
本文将详细介绍细胞培养实验中正确进行细胞计数的方法。
二、准备工作
细胞计数的准备工作至关重要，直接影响后续计数结果的准确性。以下是具体的准备步骤：
准备好细胞计数器（血球计数板）。使用 70% 乙醇将盖玻片和细胞计数板进行清洁，确保将其表面的杂质和污染物去除干净。清洁后，将盖玻片和细胞计数板放置在通风良好的地方晾干备用。在晾干过程中，要避免灰尘等杂质的污染。将晾干的盖玻片轻轻覆盖至血细胞计数器上，操作时要小心谨慎，确保盖玻片与计数板紧密贴合。注意使用前须保证盖玻片和计数板已充分晾干，否则会影响后续细胞充池及计数结果。因为如果未充分晾干，可能会导致细胞悬液在计数板上分布不均匀，影响细胞的观察和计数。
将晾干的盖玻片轻轻覆盖至血细胞计数器上。这一步骤需要特别注意盖玻片的放置位置，要确保盖玻片完全覆盖在计数板上，且没有气泡或缝隙。使用前须保证盖玻片和计数板已充分晾干，否则将影响后续细胞充池及计数结果。如果盖玻片和计数板未充分晾干，充池时细胞悬液可能无法顺利进入计数室，或者会出现细胞分布不均匀的情况，从而导致计数误差增大。
三、制备细胞悬液
细胞悬液的制备是细胞计数的关键步骤之一。对于贴壁生长的细胞，首先使用胰酶消化的方法使细胞从培养皿表面脱落。在进行胰酶消化时，要注意掌握好消化的时间和程度，避免消化太过或消化不全。消化太过可能会对细胞造成损伤，影响细胞的活性和计数结果；消化不全则会导致细胞不能完全脱落，形成细胞团，同样会使计数结果产生偏差。
消化完成后，加入适当的含血清培养基，中和胰酶的作用并重悬细胞。在重悬细胞的过程中，要尽可能将细胞吹散，不要残留任何细胞团，但不可用力过大。加入含血清培养基后，轻轻摇晃培养皿，使细胞均匀分散在培养基中。然后，使用移液器反复吹吸细胞悬液，进一步确保细胞分散均匀。
对于悬浮细胞，则无需进行胰酶消化，直接稀释到合适倍数即可。在稀释悬浮细胞时，要根据细胞的浓度和实验要求，选择合适的稀释倍数。可以使用培养基或生理盐水进行稀释，确保细胞悬液的浓度适合后续的计数操作。
如需计算细胞的活率，则需要将细胞悬液和 0.4% 台盼兰等体积混合。室温孵育 3 - 5 分钟，使台盼兰完全进入死细胞，使死细胞着蓝色。对于悬浮细胞，染色时间可视情况适当延长。在染色过程中，要轻轻摇晃混合液，确保台盼兰与细胞充分接触。染色完成后，即可进行细胞计数和活率计算。
四、血细胞计数器加样
移液器轻吹细胞悬液使其混合均匀。在进行细胞计数加样前，一定要先轻吹细胞悬液，确保细胞均匀分布，防止因细胞沉降造成取样误差增大。这样可以保证每次吸取的细胞悬液具有代表性，从而提高计数的准确性。
将细胞悬液与台盼蓝染料按 1:1 体积混合均匀。混合后的细胞悬液可以更好地分辨活细胞和死细胞，为后续的细胞计数和活率计算提供准确的数据。
取出 10uL 细胞悬液，将细胞悬液滴加于血细胞计数板边缘凹槽处，此时液滴将在虹吸的作用下进入盖玻片下方的计数池。每次加样前要混匀细胞悬液，防止细胞沉降造成取样误差增大。加样过程中，要一次性将细胞悬液注入计数室，防止气泡产生，否则要重做。加样时不要将细胞悬液直接吹入计数池，会造成细胞分布不均匀。
每次加样前要混匀细胞悬液，防止细胞沉降造成取样误差增大。如不混匀细胞悬液，细胞可能会在重力作用下逐渐沉降，导致吸取的细胞悬液中细胞浓度不均匀，进而影响计数结果的准确性。
加样过程中，要一次性将细胞悬液注入计数室，防止气泡产生，否则要重做。产生气泡会使细胞分布不均，影响读数准确性。就像在 ELISA 试剂盒酶标板实验中，加样时有气泡会导致抗原抗体不能有效结合，出现弱阳性甚至假阴性结果。同时，在 96 孔板实验中，加样后有气泡也会影响读数准确性，干扰细胞生长，改变反应环境。可以通过优化加样技巧，如控制速度缓慢而稳定地释放液体、确保移液器枪头与孔板垂直并尽量深入液面以下、预润湿枪头和孔壁等方式来减少气泡的产生。如果产生了气泡，需要重新进行加样操作。
加样时不要将细胞悬液直接吹入计数池，会造成细胞分布不均匀。如果直接吹入计数池，可能会使细胞集中在某些区域，而其他区域细胞较少，导致细胞计数不准确。参考细胞培养板试验时细胞分布不均的处理方法，我们可以从多孔板侧边或底边缓慢加入细胞悬液，或者在加入前吹打均匀，确保细胞均匀分布在计数池中。
五、细胞计数
加样后，将血细胞计数板静置数分钟。这样可以让细胞充分扩散、沉降，以便后续的观察和计数。
把血细胞计数板放置在显微镜的载物台进行观察 - 计数 - 记录。在观察时，要确保显微镜的倍数合适，能够清晰地看到细胞。计数时，要按照特定的原则进行，确保准确性。记录时，要详细记录每个大方格中的细胞数量以及其他相关信息。
分别计数大方格 1 - 2 - 3 - 4 中的细胞总数，为降低计数误差，最好将细胞浓度调整为 20 - 50 个 / 大方格。并重复记录另一侧计数池中的细胞数，总计 8 个大方块，然后取均值。计数时建议重复 1 - 2 次，取平均值，减小计数误差。四个区域的细胞数量偏差不应超过 5%，否则要重新加样。对横跨刻度上的细胞，依照 “数上不数下，数左不数右” 的原则进行计数。只计数完整的细胞，如有聚团细胞则按一个细胞进行计数。
计数时建议重复 1 - 2 次，取平均值，减小计数误差。通过多次计数取平均值，可以降低偶然误差，提高计数的准确性。例如在一些实验资料中提到，在细胞计数过程中，多次计数并取平均值是常用的方法，可以有效减少误差。
四个区域的细胞数量偏差不应超过 5%，否则要重新加样。如果四个区域的细胞数量偏差过大，说明细胞分布不均匀，可能是加样过程中出现了问题，需要重新加样以确保计数的准确性。就像在一些细胞计数的注意事项中提到，镜下计数时，若方格中细胞分布明显不均，说明细胞悬液混合不均匀，需重新将细胞悬液进行混合，再重新计数。
对横跨刻度上的细胞，依照 “数上不数下，数左不数右” 的原则进行计数。这一原则可以避免重复计数，确保计数的准确性。在一些实验方法中也明确提到了这一计数原则，如血细胞的计数实验中，对横跨刻度上的血细胞，依照 “数上不数下，数左不数右” 进行计数。
只计数完整的细胞，如有聚团细胞则按一个细胞进行计数。如果有多个细胞没有吹散而成团存在，此时只可记为一个细胞。因为聚团细胞难以准确判断其中的细胞数量，按一个细胞计数可以在一定程度上保证计数的合理性。同时，对于聚团细胞较多的情况，需要重新吹打甚至重新取样消化直至绝大多数细胞为单个细胞，以确保计数的准确性。
六、细胞浓度计算
每个大方格的容积为：1mm2×0.1mm = 0.1mm3 = 10??cm3 = 10??ml，即每个大方格的容积为万分之一毫升，因此在计算每毫升液体中的细胞数时需乘以 10?。这一特定的容积计算是细胞浓度计算的基础，确保了后续细胞计数结果能够准确转化为每毫升的细胞数量。
在常规没有使用台盼兰染色时，可以以下面公式计算每毫升样品中细胞的个数：每毫升样品中细胞的个数 = 每个大方格内细胞的平均数 × 细胞稀释倍数 ×10?。通过对多个大方格内细胞数量的统计取平均值，再结合细胞的稀释倍数以及大方格容积与每毫升的换算关系，能够较为准确地得出未染色情况下每毫升样品中的细胞总数。
如果使用了台盼兰染色，还需要计算活细胞的百分率：活细胞百分率 (%) = 台盼兰拒染细胞数 / 总细胞数 ×100。此时活细胞数的计算公式为：每毫升样品中活细胞的个数 = 每个大方格中细胞的平均数 × 活细胞比率 × 细胞稀释倍数 ×2×10?（乘 2 是由于在台盼兰染色时，进行了等体积混合，相当于稀释了一倍）。使用台盼蓝染色可以区分活细胞和死细胞，通过计算拒染细胞数与总细胞数的比例得到活细胞百分率，再结合大方格中细胞的平均数、活细胞比率、细胞稀释倍数以及因染色混合带来的稀释因素，准确计算出每毫升样品中活细胞的个数。例如，参考写作素材中提到的用台盼蓝拒染法计数活细胞的方法，先彻底混合细胞悬液，取样本进行台盼蓝染色，然后计数细胞核总数，分别统计死细胞和活细胞，最后按照特定公式计算活细胞数 /mL 和活细胞百分比。同时，在进行台盼蓝染色时，要注意染色时间不能太长，否则活细胞也会逐渐积累染料而染成颜色，使检测结果偏低。
七、注意事项
向计数板中滴细胞悬液时要干净利落，加量要适当，过多易使盖片漂移，或淹过盖片则失败，需重做，过少易出现气泡。不理想时，应重做。这是因为加量过多会导致盖片位置发生变化，影响计数的准确性；加量过少则容易产生气泡，使细胞分布不均匀，同样会影响计数结果。
镜下计数时，若方格中细胞分布明显不均，说明细胞悬液混合不均匀，需重新将细胞悬液进行混合，再重新计数。只有确保细胞悬液混合均匀，才能保证计数时每个方格中的细胞分布相对均匀，从而提高计数的准确性。
在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有 5 - 10 个菌体为宜。如果菌液浓度不合适，会影响计数的准确性。太浓时，细胞容易重叠，难以准确计数；太稀时，可能需要花费较长时间才能找到足够的细胞进行计数。
如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作为两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样品的含菌量。这样可以更准确地反映酵母的实际数量。
计数板计数时，最适浓度为 5 - 10×10?细胞 /ml，此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液，可取出部分作稀释或连续稀释后计数。如果细胞数目很少则要进行离心再悬浮于少量培养液中。当细胞浓度不在最适范围内时，计数误差会增大。高浓度细胞悬液通过稀释可以使其浓度接近最适范围，便于准确计数；而细胞数目很少时，离心再悬浮可以提高细胞的浓度，以便进行计数。
八、总结
细胞计数虽然过程繁琐，但对于细胞培养实验至关重要。掌握正确的细胞计数方法，能够为我们的实验提供准确的数据，为科学研究打下坚实的基础。
在细胞培养实验中，细胞计数的每一个步骤都需要严格操作，从准备工作中的清洁计数板和盖玻片，到制备均匀的细胞悬液，再到准确加样和细致计数，以及最后的浓度计算和注意事项，每一个环节都影响着最终结果的准确性。
正确的细胞计数方法不仅为我们提供了细胞数量的准确信息，还能帮助我们了解细胞的生长状态和活率，为后续实验的设计和优化提供有力依据。无论是细胞生物学研究、药物研发、疾病诊断还是生物技术产业，准确的细胞计数都是不可或缺的环节。
在实际操作中，我们要不断总结经验，提高操作技能，确保细胞计数的准确性和可靠性。同时，随着科学技术的不断进步，我们也可以探索和应用更加先进的细胞计数方法和工具，为细胞培养实验提供更好的支持。
