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一、原代细胞培养概述
原代细胞培养，即初代培养，是建立细胞系的首要步骤。其步骤主要包括取材、分离、培养和维持。
原代细胞培养具有诸多重要应用。首先，它为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供了有力手段。科研人员可以通过对原代细胞的观察和分析，深入了解细胞在不同条件下的生理变化。其次，原代细胞培养为传代培养创造了条件，为后续更深入的细胞研究奠定基础。此外，原代细胞培养还服务于临床实践，可用于药物筛选。例如，在抗癌药物的研发中，可以用从手术中切除的肿瘤细胞进行原代培养，然后根据肿瘤细胞对加入的化疗药物的敏感性来选择最有效的化疗方案，从而增强疗效、降低副作用。
在狂犬疫苗的研发中，原代细胞培养也发挥着重要作用。世卫组织推荐的狂犬疫苗包括三种：人二倍体细胞狂犬病疫苗、原代细胞培养疫苗以及 Vero 细胞狂犬病疫苗。其中，原代细胞培养疫苗可以用于预防狂犬病毒，虽然有一定的禁忌证和适应人群，受限较大，临床上应用不多，但它在狂犬病防治中仍具有一定的价值。
原代细胞不仅广泛应用于分子、细胞生物学和生物医学基础研究，如蛋白质组学、基因组学、细胞株（系）研究、DNA，RNA 和遗传学研究等，还可应用于当今热门的生物医药产业如药物筛选、药物代谢和毒理研究、癌症药物的研究等。原代细胞在生物医药领域有着不可替代的作用，市场前景广阔。
原代培养是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。最常用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。组织块培养是将剪碎的组织块直接移植在培养瓶壁上，加入培养基后进行培养。分散细胞培养则是将组织块用机械法或化学法使细胞分散，如用蛋白水解酶（如胰蛋白酶和胶原酶）消化细胞间的结合物，或用金属离子螯合剂（如 EDTA）除去细胞互相粘着所依赖的 Ca2+，再经机械轻度振荡，使之成为单细胞。
二、原代细胞取材方法
1. 各类组织取材
原代细胞的取材至关重要，不同类型的组织有不同的取材方法。
1. 皮肤和粘膜：
主要取自手术过程中的皮片，方法类似外科取断层皮片手术操作，面积一般为 2 - 4 平方厘米。
2. 内脏和实体瘤：
内脏除消化道外基本是无菌的，取材时要明确并熟悉所需组织类型和部位。取实体瘤组织时，要取肿瘤细胞丰富的区域，避开破溃、坏死液化部分，以防污染，同时尽量去除混杂的结缔组织。
3. 血液细胞：
一般多抽取静脉外周血，或从淋巴组织中（如脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等）分离细胞，取材时应注意抗凝。
4. 骨髓、羊水、胸 / 腹水细胞：
严格无菌，注意抗凝，取材后尽快分离培养。离心后用无钙、镁 PBS 洗两次，再用培养液洗一次后即可培养，不宜低温存放。
5. 动物组织取材 - 鼠胚组织：
用引颈或气管窒息致死法处死孕期合适动物，然后将其整个浸泡在含有 75% 酒精的烧杯中，5 分钟后取出动物（注意时间不能太长，以免酒精从口或其他通道进入体内，影响组织活力）。在消毒过的木板上用无菌的图钉或大头针固定四肢，切开皮肤，用无菌操作法解剖取胚或用无菌止血钳挟起皮肤、用无菌眼科剪沿躯干中部环形剪开皮肤，用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾，把动物反包，暴露躯干，然后再固定，更换无菌解剖器材，采用无菌操作法解剖取出胚胎。
6. 动物组织取材 - 幼鼠胚肾（或肺）：
幼鼠采用上述方法处死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切开游离毛皮并拉开至两侧，然后采用无菌法打开胸腔取肺；或背部朝上固定在木板上，先将背部毛皮切开游离并拉向两侧，然后采用无菌法从背部打开腹腔取肾。
7. 鸡（鸭）鸟类胚胎组织：
取孵化至适当胚龄（9 - 12 天）的胚蛋，用照蛋灯在暗处灯检，若有丰富血管、胚体有运动的胚蛋，说明胚体发育良好，并用有色笔划出气室和胚体位置。将胚蛋置于蛋架上，先用温水清洗蛋壳，再用 75% 酒精棉球擦干；经碘酒、75% 酒精消毒后，在无菌条件下采用无菌法用剪刀或镊子打开气室，沿气室边缘去除蛋壳；用眼科镊撕去壳膜，暴露出鸡胚；用弯头镊轻挑起胚头，取出胚胎，放入无菌平皿中，解剖取材。
三、原代细胞分离方法
1. 悬浮细胞的分离方法
当组织材料来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料时，可以采用较为简单的方法进行悬浮细胞的分离。首先，以 1000r/min 的低速离心 10 分钟。经过离心处理后，由于各种细胞的比重不同，会在分层液中形成不同的层次，这样就可以根据实际需要收获目的细胞。
2. 实体组织材料的分离方法
对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，需要采用特定的方法使细胞充分分散，形成细胞悬液。主要有机械分散法和消化分离法。
1. 机械分散法：这种方法简便快速，但存在一些局限性。它对组织的机械损伤较大，细胞分散效果也较差，只适用于纤维成分少的软组织。具体操作是用无菌剪刀或手术刀将组织标本切成小块，然后用吸管反复吹打，分散组织细胞；或者将已充分剪碎分散的组织放在注射器内，使细胞通过针头压出；还可以在不锈钢纱网内用钝物压挤使细胞从网孔中压挤出。
2. 消化分离法：
（1）酶消化分离法：常采用胰蛋白酶和胶原酶。胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水解作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水解而使细胞分散开。胶原酶是从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用，适于消化纤维性组织、上皮组织及癌组织。此外，还有链霉蛋白酶、粘蛋白酶等其他消化酶。
（2）非酶消化法（EDTA 消化法）：EDTA 是一种非酶消化物，又称螯合剂或 Versene，全名为乙烯二胺四乙酸。常用不含钙、镁离子的 PBS 配成 0.02% 的工作液，对一些组织，尤其是上皮组织分散效果好。该化学物质能与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物，利用结合后的机械力使细胞变圆分散或使贴壁细胞脱离。
3. 操作步骤：剪切、加液漂洗、消化、弃去消化液、漂洗、机械分散。首先将组织块剪切，然后用液体漂洗，接着加入消化酶进行消化，消化完成后弃去消化液，再次漂洗，最后进行机械分散。
4. 注意事项：组织块必须漂洗 2 - 3 次，以除去钙、镁离子和血清对胰蛋白酶和 EDTA 的抑制作用。胰蛋白浓度不宜过高，作用时间不能太长，避免产生毒性作用。消化后动作要轻，尽量弃去消化液，防止膨松的细胞随漂洗而丢失。
四、原代细胞培养注意事项
1. 组织块培养法
在进行组织块培养时，需要注意以下几点：
前 3 天避免引起液体振荡，防止组织块脱落。这是因为组织块在接种后的前几天粘附不牢固，液体的振荡或频繁翻动、振动都可能导致组织块不易附着于瓶壁上，甚至脱落飘起。
加入培养液不宜过多。过多的培养液可能使浸泡的组织块受轻微波动而脱落。
去除漂浮组织块和残留细胞。当细胞向外迁徙出来后，漂浮的组织块和残留细胞会产生有毒物质，影响原代细胞的生长，所以要及时记录并去除。
可先将胶原薄层涂在培养瓶底壁促进组织块粘贴。这样能帮助组织块更快地附着在瓶壁上，提高培养的成功率。
2. 贴壁型原代细胞
对于贴壁型原代细胞，要注意以下方面：
接种细胞密度要适当，过低或过高都不利于细胞生长。如果接种的细胞密度过低，细胞之间的促生长作用很小，难以使细胞适应从体内组织环境到体外独立生存环境的变化；若密度过大，则会导致营养物质供应不足，代谢废物积累较快，需要经常换液和传代。
先将培养瓶置培养箱内 3 - 5h 使细胞贴壁后再补足培养液继续培养。尽快使接种的细胞贴壁是决定培养能否成功的关键，细胞悬液中带有少量培养液，既可以维持细胞存活，又能让细胞很快接触到培养瓶底壁，迅速黏附于底物。
3. 悬浮型原代细胞
悬浮型原代细胞的培养需注意：
保持细胞悬浮状态，可增加培养液黏度或使用搅拌装置，注意勿使搅拌速度过快避免污染，换液时不要吸出细胞。可以通过给培养液中加入低浓度的透明质酸复合物来增加培养液黏度，帮助细胞呈悬浮状态。在有搅拌装置的培养器皿内加入培养液时，要以 5ml 为最低限度，否则搅拌时会产生气泡对细胞造成伤害。如果培养液的量在 5ml 以下，可以采用旋转瓶培养。
生命力旺盛，换液时间隔较短。因为能够进行悬浮培养的细胞体外分裂增殖速度较快，营养成分消耗大。
4. 其他注意事项
1 - 2 天内注意观察是否有细菌、真菌污染，防止交叉感染。在原代培养的初期，要特别留意细菌、真菌的污染情况，一旦发现要及时清除，避免造成其他细胞的交叉感染。
随着培养进程，及时换液，注意培养液营养成分和代谢产物变化。
