Tel：13770851495
一、CFSE 增殖检测概述
CFSE，即羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂，是一种在细胞增殖检测中广泛应用的荧光染料。它具有可穿透细胞膜的特性，其原理是当进入细胞后，内源的酯酶可将其乙酸基团水解，使其具有很高的荧光活性，同时其含有的琥珀酰亚胺酯基团能与胞内的细胞骨架蛋白中的游离胺基反应，最终形成具有荧光的蛋白加合物。
在细胞分裂增殖过程中，CFSE 标记荧光可平均分配至子代细胞中。随着细胞分裂次数的增加，荧光强度逐渐递减，这使得通过流式细胞仪检测分析成为可能。例如，在细胞增殖示踪荧光探针（CFDA SE）的应用中，激发波长通常为 492nm（荧光 FITC 滤片检测）或 488nm 流式激发光检测，发射波长为 517nm。经 CFDA, SE 标记的非分裂细胞的荧光非常稳定，稳定标记的时间可达数月，非常适用于细胞群落分析。而且，CFDA, SE 标记细胞的荧光非常均一，分裂后的子代细胞的荧光分配也更均一。
CFSE 的应用范围广泛，不仅常用于淋巴细胞的增殖检测，还可用于成纤维细胞、自然杀伤细胞、造血祖细胞等其他细胞的增殖检测。在细胞增殖检测中，它可以检测分裂次数多达八次甚至更多。同时，CFSE 还可用于体内示踪、细胞荧光标记和细胞毒性检测等领域。
在实际操作中，CFSE 储存液（5mM）可通过用 1ml DMSO 溶解 2.79mg CFSE 配制得到，该储存液需立即使用，如有剩余应分装后于≤-20℃避光干燥保存，避免反复冻融。使用前用含 20mM Hepes 的 Hanks 缓冲液（HHBS）或其他不含氨基的合适缓冲液（pH = 7.0）对储存液进行 1,000~10,000 倍稀释，可得到 CFSE 工作液（0.5 - 5μM）。
在细胞增殖检测方法大盘点中，活细胞荧光标记方法之一就是利用 CFSE。CFSE 能够轻易穿透细胞膜，在活细胞内聚积并与胞内蛋白共价结合，水解后的 CFSE 释放出荧光物质，这些共价结合的荧光分子很少从细胞内脱落。当细胞分裂时，CFSE 标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。这样，在一个增殖的细胞群体，各连续代细胞的荧光强度呈对数递减，利用流式细胞仪在 488nm 激发光和荧光检测通道可对其进行分析，从而得到细胞增殖情况。
此外，在细胞增殖检测中还有多种方法，如直接计数法、检测细胞代谢活性（MTT、CCK - 8、MTS、XTT 及 SRB 法等）、检测细胞 DNA 合成（BrdU/EdU 检测法）、检测 ATP 含量、检测细胞增殖相关抗原等。这些方法各有优缺点，可根据实验方案和实验目的的不同进行选择。
在大鼠骨髓间充质干细胞体外 CFSE 染色标记的实验研究中，CFSE 用于 BMSCs 的体外标记。荧光显微镜下观察可见，标记 CFSE 的 BMSCs 细胞膜、细胞质和细胞核都发出绿色荧光，整个细胞呈绿色，细胞核的荧光强度最高。实验还探讨了 CFSE 的最佳标记浓度和最佳标记时间，结果显示在一定条件下，CFSE 标记不影响细胞的生命活动，但当 CFSE 标记浓度达到 20μmol/L 或标记时间＞20min 时，BMSCs 的存活率将会降低，甚至部分细胞出现死亡。故在 CFSE 对 BMSCs 标记率都达到 100% 的前提下，选择较低的作用浓度和较短的作用时间，即 10μmol/L CFSE 标记 15min，作为 CFSE 标记 BMSCs 的最佳条件，以在达到 CFSE 最佳标记效果的同时保持最佳的细胞活性。
在 CFSE 标记细胞的过程中，CFSE 的浓度国外报道从 0.5uM~20uM 都有，建议终浓度为 2.5 - 5uM。浓度太低，细胞标记的荧光强度不够，太高了对细胞有毒性，且影响细胞增殖。标记孵育时要经常摇匀。
铭修生物介绍了 CytoFLEX 流式细胞仪 + 荧光染料 CFSE 检测细胞增殖的方法。在实验中，通过在 FSC/SSC 上圈出淋巴细胞，使用 FSC - W/FSC - A 排除黏连体，CFSE/CD19 图中圈出 CD19 阳性细胞，使用 CFSE 单参分别看淋巴细胞与 CD19 阳性（B 细胞）的增殖情况。结果显示，经过 CpG 刺激 3 天后的 CD19 阳性细胞增殖效率比对照组有明显的提升。
FlowJo 分析细胞增殖也可采用 CFSE 法。CFSE（CFDA - SE）是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。在细胞分裂增殖过程中，其标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，荧光强度是亲代细胞的一半。通过 FlowJo 的增殖分析平台，可对细胞增殖进行分析，包括确定要分析的目标细胞群、打开增殖分析平台、调整增殖分析平台左下角的 “Options” 选项中的参数等步骤，以得到最佳的拟合结果。分析结果中的参数如 RMS、#Peaks、Peak cv、Peak ratio、Undiv. Mean、Div. Index、Prol. Index、% Divided、Background 等，可用于解释细胞增殖的情况。
二、CFSE 增殖检测的应用场景
1. 细胞增殖检测
CFSE 在细胞增殖检测方面具有显著效果，尤其对淋巴细胞的增殖检测效果尤为突出。可用于检测活细胞以及通过荧光显微镜对细胞活动进行长期观察。研究表明，CCK - 8 法、EdU 标记法、CFSE 标记法均可用于检测不同培养条件下细胞的体外增殖，其中 EdU 和 CFSE 标记法更适用于悬浮类免疫细胞的增殖检测，如 NK92 细胞。此外，CFSE 可检测分裂次数多达八次甚至更多，其标记荧光在细胞分裂增殖过程中可平均分配至子代细胞中，随着细胞分裂次数的增加，荧光强度逐渐递减，通过流式细胞仪检测分析成为可能。
2. 体内示踪
CFSE 可在体内监测数周，用于体内跟踪和细胞的迁移定位。例如，基于 CFSE 染色的小鼠淋巴细胞体内示踪方法的建立中，确定了以 PBS 作为孵育液、CFSE 终浓度选择 10μmol/L 对小鼠淋巴细胞标记、注射剂量为细胞 5×106 个 / 只，可使 CFSE＋细胞信号在同系小鼠体内持续 2 个月。
3. 细胞荧光标记
CFSE 的荧光标记稳定，可用于细胞标记及定位。CFSE 标记细胞的荧光非常均一，优于以前使用的其他细胞示踪荧光探针，经 CFDA, SE 标记的非分裂细胞的荧光非常稳定，稳定标记的时间可达数月，非常适用于细胞群落分析。
4. 细胞毒性检测
CFSE 与其他检测方法结合，可用于检测免疫效应细胞的细胞毒功能。如 CFSE /7-AAD 双染细胞毒性检测试剂盒，利用细胞荧光染料 CFSE 和 7-AAD 对细胞进行染色，区分不同的细胞，活的靶细胞成绿色，死的靶细胞成红色和绿色，从而检测细胞毒性作用。此外，免疫效应细胞的增殖与细胞毒性功能的三种检测方法的对比研究中，CCK - 8 法更侧重于检测代谢活性，EdU 和 CFSE 标记法更适用于悬浮类免疫细胞的增殖检测；三种细胞毒功能检测具有一致性，活细胞染料双标法适合检测对悬浮类靶细胞的杀伤，荧光素酶法比 LDH 释放法更适用于贴壁细胞的杀伤。
三、CFSE 增殖检测的方法步骤
1. 试剂配制
CFSE 的储存液配制需用 DMSO 溶解成 5mmol/L 的浓度，于 -20℃避光保存。使用时，用含 20mM Hepes 的 Hanks 缓冲液或其他不含氨基的合适缓冲液（pH = 7.0）对储存液进行稀释，得到 0.5 - 5μM 的工作液。
2. 操作方法
首先用适当药物处理细胞后，离心收集细胞并调整浓度。接着，用 CFSE 工作液悬浮细胞，可于室温或 37℃避光孵育 10 - 30min。孵育完成后，吸除染液，用预热缓冲液或培养液清洗细胞，最后用预热缓冲液或培养液悬浮细胞。在特定波长下，可使用流式细胞仪或荧光显微镜观察细胞。例如，在 Ex/Em = 490/520nm 下用流式细胞仪（FL1 通道）或荧光显微镜观察细胞；也可在激发波长为 492nm（荧光 FITC 滤片检测）或 488nm 流式激发光检测，发射波长为 517nm 下进行观察。CFSE 的浓度应控制在合适范围内，国外报道从 0.5uM~20uM 都有，但建议终浓度为 2.5 - 5uM。浓度太低，细胞标记的荧光强度不够；太高了对细胞有毒性，且影响细胞增殖。在标记孵育时要经常摇匀。
四、CFSE 增殖检测的难点及解决方案
1. 难点
CFSE 浓度难把握，浓度太低荧光强度不够，太高对细胞有毒性且影响增殖。
在进行 CFSE 增殖检测时，CFSE 的浓度把控是一个关键问题。如果浓度过低，细胞标记的荧光强度不足，会影响检测的准确性和灵敏度。例如，当 CFSE 浓度低于建议的范围时，在流式细胞仪检测中可能难以清晰地分辨出标记的细胞，导致无法准确判断细胞的增殖情况。
而当浓度过高时，CFSE 会对细胞产生毒性，不仅可能影响细胞的正常生长和增殖，还可能导致细胞形态和功能发生改变，甚至引起细胞死亡。这种毒性作用会干扰实验结果，使检测结果不能真实反映细胞的增殖状态。
细胞报团问题，实验中细胞可能不报团影响观察。
在 CFSE 增殖检测实验中，细胞报团问题也会给实验带来困扰。如果细胞不报团，会影响对细胞的观察和分析。例如，在荧光显微镜下观察时，分散的细胞可能难以形成清晰的图像，不利于对细胞形态和荧光标记情况的观察。
此外，在流式细胞仪检测中，细胞不报团可能导致细胞分布不均匀，影响数据分析的准确性。
2. 解决方案
控制 CFSE 浓度在 2.5 - 5uM，标记孵育时经常摇匀。
为了解决 CFSE 浓度难把握的问题，建议将 CFSE 浓度控制在 2.5 - 5uM 这个范围内。这个浓度范围是经过大量实验验证的，既可以保证细胞标记的荧光强度足够，又能最大程度地减少对细胞的毒性影响。
在标记孵育过程中，经常摇匀也是非常重要的。这可以确保 CFSE 均匀地分布在细胞悬液中，避免局部浓度过高或过低的情况发生。同时，摇匀还可以促进 CFSE 与细胞的充分接触，提高标记效率。
调整细胞密度、检查 CFSE 浓度、优化细胞处理条件、选择合适实验时间点等解决细胞不报团问题。
对于细胞报团问题，可以通过调整细胞密度来解决。如果细胞密度过高，容易导致细胞报团。适当降低细胞密度，可以减少细胞之间的接触，降低报团的可能性。
检查 CFSE 浓度也是必要的。如果 CFSE 浓度过高，可能会影响细胞的正常形态和功能，导致细胞报团。确保 CFSE 浓度在合适的范围内，可以减少细胞报团的发生。
优化细胞处理条件也是解决细胞报团问题的关键。例如，在细胞培养过程中，注意培养基的成分、温度、pH 值等条件，保持细胞处于良好的生长状态。在细胞传代和处理过程中，避免过度消化或损伤细胞，以免影响细胞的正常形态和功能。
选择合适的实验时间点也很重要。如果实验时间过长，细胞可能会因为生长状态的改变而出现报团现象。
