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一、肿瘤研究中的细胞迁移、侵袭和增殖实验重要性
细胞迁移、侵袭和增殖实验在肿瘤研究中具有至关重要的地位，它们为深入了解肿瘤的发生发展机制提供了关键线索，也是评估肿瘤恶性程度和治疗效果的重要指标。
肿瘤细胞的增殖失控、分化异常以及侵袭和转移的能力是恶性肿瘤最基本的生物学特征。其中，细胞迁移、侵袭和增殖实验在肿瘤研究中扮演着关键角色。
细胞迁移是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。在胚胎发育、血管生成、伤口愈合、免疫反应、炎症反应、肿瘤转移等多个过程中都涉及到细胞迁移。由于转移性疾病是导致癌症死亡的关键因素，因此了解细胞迁移机制对于癌症研究至关重要。
细胞侵袭是细胞迁移的一种，与细胞迁移密不可分。肿瘤细胞的侵袭性是肿瘤相关信号通路、药物治疗、靶向治疗、致癌 / 抑癌基因等肿瘤学研究的一个重要指标。检测细胞迁移能力最常见的方法是细胞划痕实验和 Transwell 小室检测。细胞划痕实验操作简单，经济实惠，主要用来检测细胞在 2D 空间中的迁移能力，类似体外伤口愈合模型。Transwell 小室检测则可以模拟细胞在 3D 空间的迁移，同时也是检测细胞侵袭能力最常用的手段。
细胞增殖是肿瘤发展的重要特征之一。通过体外检测肿瘤细胞增殖实验，可以帮助科研人员深入了解肿瘤发生和发展的机制，探讨肿瘤细胞的增殖速度、抑制剂对肿瘤增殖的影响等问题。常用的细胞增殖实验方法包括 MTT 法、CCK-8 法、CellTiter-Glo?法等。
综上所述，细胞迁移、侵袭和增殖实验在肿瘤研究中具有不可替代的重要性，为肿瘤的预防、诊断和治疗提供了重要的理论基础和技术支持。
二、细胞增殖与肿瘤的关系
（一）肿瘤生长速度的决定因素
肿瘤细胞的增殖速度是肿瘤生长的主要因素，细胞不断增殖使肿瘤体积增大。肿瘤的生长速度主要取决于肿瘤细胞的增殖速度，当肿瘤细胞不断增殖，就会不断地形成新的癌细胞，从而使肿瘤的体积增大。
肿瘤的恶性程度影响生长速度，恶性肿瘤通常生长更快。一般而言，恶性肿瘤比良性肿瘤的生长速度更快，肿瘤细胞和正常细胞在形态和功能上差别较大时，通常代表分化程度较低，其生长速度则较快。
局部环境如血液供应、氧气浓度和营养物质供应等对肿瘤生长速度有很大影响。肿瘤的生长速度与局部环境有很大关系，例如，肿瘤生长所需要的血液供应、氧气浓度以及营养物质的供应等因素都会影响肿瘤的生长速度。
遗传因素可能导致肿瘤细胞增殖速度异常快。有些肿瘤具有明显的遗传因素，这些遗传因素可能导致肿瘤细胞的增殖速度非常快。
（二）细胞增殖的含义及与肿瘤的关联
细胞增殖是细胞生长发育、遗传和繁殖的基础，人类哺乳动物细胞通过有丝分裂进行增殖。细胞的增殖过程也有人体内一定的调控机制，一旦丧失了调控会导致细胞无法控制的增殖，会导致出现恶性病变。恶性肿瘤的细胞就会无止境的增殖，因此会导致局部病变，细胞本身的生理功能丧失和形态异常，还会导致出现局部的浸润、远处的转移，影响到人体健康。
（三）细胞周期分析与肿瘤的关系
细胞周期分析可以提供有关肿瘤细胞增殖和分化状态的重要信息，从而有助于了解肿瘤的发展和治疗。正常细胞有一个严格的调控机制来确保细胞周期的正常进行，在每个阶段都有相应的检查点来监测和纠正细胞 DNA 的完整性和正确复制。然而，当细胞的基因突变或异常发生时，这些调控机制可能失效，导致细胞周期紊乱，使细胞无法停止增殖或进入凋亡状态。细胞周期的紊乱与肿瘤的发生密切相关。有两类基本的细胞周期调控蛋白，即促进蛋白（如细胞周期蛋白）和抑制蛋白（如细胞周期抑制蛋白），通过复杂的相互作用来调控细胞周期。如果这些调控蛋白发生突变或异常表达，细胞周期的正常调控机制可能被破坏，促使细胞无限制地分裂和增殖，从而形成肿瘤。
三、细胞侵袭对肿瘤的影响
（一）肿瘤的形成过程
肿瘤的形成是一个复杂的过程，涉及多个步骤。基因突变是肿瘤形成的关键因素，它可以由遗传因素或环境因素引起。基因突变会影响细胞的生长调控机制，导致细胞异常增殖。细胞侵袭是肿瘤细胞脱离原发瘤，向周围间质浸润生长的阶段，这是肿瘤转移的前提。肿瘤转移则是肿瘤细胞脱离原发生长部位，在机体内其他部位形成转移瘤的过程。
（二）肿瘤细胞的特性
良性肿瘤细胞形态规则，不蔓延扩散，不侵入破坏其他组织；恶性肿瘤细胞形态不规则，具有浸润和转移能力，能破坏周围组织并转移到其他器官和淋巴结。良性肿瘤与恶性肿瘤在细胞特征上存在明显差异，良性肿瘤细胞具有良好的组织完整性，而恶性肿瘤细胞则具有强大的浸润和转移能力，会在周围组织内破坏和浸润，并可能转移到其他器官和淋巴结。
良性肿瘤生长速度慢，不超过原本器官范畴；恶性肿瘤生长迅速，可在短时间内增大并侵袭周围组织，发生转移。良性肿瘤生长缓慢，通常需要多年时间才会达到较大规模，且生长不会超过原本器官的范畴；而恶性肿瘤生长极为迅速，可以在短时间内快速增大，当肿瘤细胞开始侵袭周围正常组织时，就能够进一步扩散至其他部位，最终引起恶性肿瘤的转移。
良性肿瘤危害相对较小，除非压迫器官；恶性肿瘤具有侵袭和转移能力，会对多个器官和系统造成广泛损害，危及生命。良性肿瘤一般对身体的危害相对较小，除非存在压迫和影响器官功能的情况；而恶性肿瘤由于其具有侵袭和转移的能力，会导致身体多个器官和系统发生广泛的损害，严重时甚至危及患者的生命。
良性肿瘤可手术切除且不易复发；恶性肿瘤需综合多种治疗方式。良性肿瘤可以通过手术切除，尤其是在早期，切除后不容易复发；而恶性肿瘤常用的治疗方式包括手术、化疗、放疗、免疫治疗等多种方法，但往往需要综合使用，以达到最佳治疗效果。
（三）肿瘤免疫阻断疗法对细胞侵袭的抑制作用
肿瘤转移是癌症患者的噩梦，控制肿瘤细胞的侵袭扩散是提高治疗效果、改善患者生存质量的有效措施。肿瘤免疫阻断治疗能有效遏制癌细胞的侵袭与转移，针对肿瘤转移的各个环节，从根本上抑制肿瘤侵袭转移。
肿瘤免疫阻断疗法正是针对肿瘤转移的各个环节，环环相扣，从根本抑制肿瘤侵袭转移。肿瘤发生侵袭生长到一定阶段才可以出现转移，通过生物免疫阻断剂激活人体免疫细胞和 p53 基因，诱导癌细胞凋亡，使得肿瘤进展得到控制，控制在肿瘤侵袭的过程，新转移将不再发生。免疫阻断疗法除了增强免疫活性，抑制癌转移和诱导癌细胞凋亡，免疫阻断剂还可抑制血浆血管内皮生长因子 VEGF 的活性度，从而抑制肿瘤新血管的生成，阻止癌转移灶生成。同时免疫阻断剂对肿瘤细胞间的粘附和迁移起到明显的抑制作用，有效控制肿瘤的病变转移，对于尚未出现转移的早中期患者，它可以提高早期肿瘤手术的治愈率防止术后并发症。此外对于已经发展为晚期出现广泛转移的患者，免疫阻断剂可增加放化疗的疗效，减轻放化疗的各种副作用，改善患者临床症状，提高患者的生存期。
四、细胞迁移在肿瘤研究中的重要性
（一）细胞迁移 / 侵袭简介
细胞迁移是细胞在接收到迁移信号后产生的移动，在胚胎发育、血管生成、伤口愈合、肿瘤转移等过程中都涉及到。细胞侵袭是细胞突破基底膜进入血管、淋巴管的过程，常发生于伤口修复、肿瘤转移等过程中。细胞迁移和侵袭在肿瘤研究中具有重要意义，因为它们与肿瘤的转移密切相关。检测细胞迁移和侵袭能力对肿瘤研究很重要，可以帮助我们更好地了解肿瘤的发展和转移机制，为肿瘤的治疗提供新的思路和方法。
（二）细胞划痕实验
原理：模拟体外伤口愈合模型，检测细胞在 2D 空间的迁移能力。细胞划痕实验的基本原理是在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为 “划痕 / 伤口”，划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使 “划痕 / 伤口” 愈合，在一定程度上模拟了体内细胞迁移过程。
步骤：
培养板划线：先用 marker 笔在 6 孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔 0.5 - 1cm 一道，横穿过孔，每孔至少穿过 5 条线。
铺板：处于对数生长期的细胞，胰蛋白酶消化成单细胞悬液，接种于 6 孔培养板；细胞铺板 6w / 孔，接种原则为过夜后融合率达到 100%，每孔最终的培养基总量 2mL。
细胞培养：37℃、5％CO2 培养箱中培养 24h。
划痕：第二天用 200 微升枪头比着 6 孔板盖子或直尺，平行或垂直于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。
清洗：PBS 冲洗细胞 3 次，除去划下的细胞，加入无血清培养基。
拍照：擦去 6 孔板背后的 marker 横线划痕。4 倍镜下进行拍照，保证划痕居中且垂直，注意背景一致，加入待测样本，设置浓度梯度，可按 0，6，12，24h 时间点取样，拍照。
结果分析：使用 Image J 软件打开图片后，随机划取 6 至 8 条水平线，计算细胞间距离的均值或者划痕面积均值。
注意事项：
选择合适的培养板：铺板时一般选择 6 孔板，因为 6 孔板大小适中，可保证有相当距离的平直划痕，便于观察。而且因为有 5 条定位线，与划痕相交，这样就有 10 个可固定监测点，不作重复，误差也很小。但是如果实验需要高通量初筛，也可以用 12 或 24 孔板。
注意细胞生长状况：实验时应注意细胞生长状况，选择适当的细胞接种浓度。对不同类型细胞要观察细胞贴壁率等，确定实验时细胞种板数量和培养时间，保证培养终止时密度适当。
减少细胞增殖影响：应选择加入无血清或血清浓度低（≤2%）的培养基进行细胞培养。也可以先用丝裂霉素（1μg/ml）处理 1h，抑制细胞的分裂。
选择合适培养基：实验过程中需要选择合适的培养基，以保证细胞的正常生长和迁移。
优缺点：
优点：操作简便，不需要借助特殊的实验仪器；实验成本低。
缺点：操作者划痕易出现宽度不均一，影响划痕愈合度评估；划痕会对周围细胞造成机械损伤，影响细胞活性；不太好排除增殖带来的影响。
（三）Transwell 小室检测
原理：将小室放入培养板中，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，上室内添加上层培养液，下室内添加下层培养液。将细胞种在上室内，由于膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。肿瘤迁移实验中，研究肿瘤细胞的迁移能力或特定情况下肿瘤细胞的迁移能力，常用 8.0、12.0μm 膜，上室种肿瘤细胞，下室加入 FBS 或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室迁移，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。肿瘤侵袭实验中，与肿瘤细胞迁移实验不同的是，需在聚碳酸酯膜上侧铺一层基质胶，用以模仿细胞外基质，上室种肿瘤细胞，若细胞要进入下室，必须先分泌基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）将基质胶分解，才能通过聚碳酸酯膜下室，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力。
应用：通过选择不同孔径和处理的滤膜，可进行共培养、细胞趋化、迁移、侵袭等研究。应用包括细胞迁移、趋化（趋化因子对细胞的定向诱导），侵袭（癌细胞侵袭上指肿瘤细胞向局部侵犯或远处转移），共培养（同一培养体系里，两种细胞非接触性培养）。
结果展示：客户提供细胞株（冻存株或培养细胞）及处理用的药物，细胞培养基信息，细胞特殊处理方式。HYY 提供原始图片、原始数据，完整实验报告。
五、肿瘤研究的主要实验有哪些
肿瘤研究的主要实验包括多种类型，2019 年肿瘤领域公布了多项主要临床试验结果，如免疫治疗、PARP 抑制剂和细胞周期蛋白激酶（CDK）4/6 抑制剂等药物在肿瘤治疗中的应用。但这些并非肿瘤研究的三大关键实验。
肿瘤研究中常用的实验有大肠杆菌感受态细胞的制备与转化、微生物鉴定中常用的生化反应、PCR 扩增和扩增产物克隆等，但这些实验与肿瘤研究的三大关键实验也不同。
在肿瘤研究中，细胞迁移、侵袭和增殖实验被认为是肿瘤恶性化表型研究中最常见的三大金标实验。细胞划痕实验是检测细胞迁移能力最常见的方法之一，其原理是在融合的单层细胞上制造划痕，模拟体外伤口愈合模型，观察细胞在 2D 空间的迁移能力。Transwell 小室检测则可以模拟细胞在 3D 空间的迁移，同时也是检测细胞侵袭能力最常用的手段。CCK8 增殖实验是检测细胞增殖能力的常用方法，通过检测细胞活性间接反映细胞增殖情况。
综上所述，细胞迁移、侵袭和增殖实验在肿瘤研究中具有重要地位，是肿瘤研究的三大关键实验。
六、肿瘤研究的三大金标实验详解
（一）细胞划痕实验
原理：细胞划痕实验的基本原理是在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为 “划痕 / 伤口”，划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使 “划痕 / 伤口” 愈合，于细胞迁移过程中在开始和定期捕获图像，通过测量不同时间点的划痕间距并计算差值，可对细胞的迁移能力做出判断。因其类似体外伤口愈合过程，又名伤口愈合实验 (Wound healing assay)。细胞迁移为细胞头部伪足的延伸、新的黏附建立、细胞体尾部收缩在时空上的交替过程。细胞迁移是正常细胞的基本功能之一，是机体正常生长发育的生理过程，也是活细胞普遍存在的一种运动形式。胚胎发育、血管生成、伤口愈合、肿瘤转移等过程中都涉及细胞迁移。
步骤：
划线：先用 marker 笔在 6 孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔 0.5 - 1cm 一道，横穿过孔，每孔至少穿过 5 条线。
铺板：处于对数生长期的细胞，胰蛋白酶消化成单细胞悬液，接种于 6 孔培养板；细胞铺板 6w / 孔，接种原则为过夜后融合率达到 100%，每孔最终的培养基总量 2mL。
细胞培养：37℃、5％CO2 培养箱中培养 24h。
划痕：第二天用 200 微升枪头比着 6 孔板盖子或直尺，平行或垂直于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。
清洗：PBS 冲洗细胞 3 次，除去划下的细胞，加入无血清培养基。
拍照：擦去 6 孔板背后的 marker 横线划痕。4 倍镜下进行拍照，保证划痕居中且垂直，注意背景一致，加入待测样本，设置浓度梯度，可按 0，6，12，24h 时间点取样，拍照。
结果分析：使用 Image J 软件打开图片后，随机划取 6 至 8 条水平线，计算细胞间距离的均值或者划痕面积均值。
（二）Transwell 侵袭实验
原理：利用一层膜（基质胶）将高营养的培养液和低营养的培养液隔开，细胞放在低营养的培养液里，为了寻找营养，细胞会往高营养的培养液里面迁移。主要是模拟细胞分泌金属蛋白酶消化细胞外基质，转移至其他组织的过程。由于只有具有侵袭能力的细胞才可进行 Transwell 侵袭实验。因此实验前最好先用明胶酶谱法检测 MMPs 的表达。
步骤：
细胞饥饿：让细胞撤血清饥饿 12－24h，去除血清的影响。
制备基质胶：在无菌条件下将 Matrigel 胶冰浴融化。然后用无血清培养基稀释配制 Matrigel，比例 1：4 - 1：8，稀释后在 Transwell 小室上室铺 40ul / 孔。
水化：37℃放置 2h，至 Matrigel 胶凝固，用无血清培养基水化 30min。
消化细胞：用预热胰酶消化细胞，显微镜下观察细胞脱离培养皿形成单个或者团状的细胞，加入培养基终止消化反应。
重悬细胞：PBS 轻洗细胞 3 次，用含 BSA 的无血清培养基重悬。调整细胞密度至 1－10×105 细胞处理后，取 10 万细胞铺到上室。
接种细胞：将处理后的细胞接种到 Transwell 小室上室。
染色和计数：48h 后待细胞穿到下室，用棉签轻轻擦去基质胶和上室内的细胞。小室于室温彻底风干，以方便后一步染色。0.1% 结晶紫染色，PBS 洗去多余结晶紫。Transwell 小室与正置显微镜进行观察和拍照，随机选取多个视野进行细胞计数。
（三）CCK8 增殖实验
原理：WST-8 在电子耦合载体 1-Methoxy PMS 存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色甲臜产物，颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。对于许多肿瘤耐药株，可以在实验组与对照组加入药物处理后，可以通过 cck8 检测使用酶标仪在 450nm 波长处测定 OD 值，间接反映细胞活性。
步骤：
细胞预培养：细胞消化为细胞悬液后，取 96 孔板，每空加入 100μL。置于培养箱预培养 24 小时（37℃，5% CO2）。在 96 孔板的四围可以加入 PBS，防止细胞培养过程中液体蒸发过多。
加入药物：12、24、48 小时分别向培养板加入待测药物试剂。
CCK8 检测：弃去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的 100ul 培养基，向每孔加入 10μLCCK8 溶液。其中预留的 PBS 孔加入 CCK8 作为空白组。将培养板在 37 度培养箱内孵育 1 - 4h。
计算细胞活力：酶标仪测定在 450nm 处的吸光度。细胞活力计算公式如下：细胞活力（％）=[A (加药)-A（空白）]/[A（0 加药）-A（空白）]×100。其中：A（加药）：具有细胞、CCK8 溶液和药物溶液的孔的吸光度。A（空白）：具有培养基和 CCK8 溶液而没有细胞的孔的吸光度。A（0 加药）：具有细胞、CCK8 溶液而没有药物溶液。
