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一、脓毒症模型构建的重要意义
脓毒症在临床上是一种形势极为严峻的疾病，其具有高发病率、高死亡率的特点。全球每年有超过 1800 万严重脓毒症病例，美国每年就有 75 万例脓毒症患者，并且这一数字还在以每年 1.5% - 8.0% 的速度持续上升，其发病率约为 0.3%，病死率约为 30 - 40%，脓毒症休克病死率更是高达约 50%，如今其病死率已经超过了前列腺癌、乳腺癌和艾滋病。此外，脓毒症的发病机制至今尚未完全明确，临床上引发脓毒症的诱因众多，常见的如肺炎、腹膜炎、胆管炎、泌尿系统感染、脑膜炎、脓肿等，还可由细菌、真菌、病毒及寄生虫等引起，往往会同时累及多个脏器，导致脏器功能受损或者是衰竭。
在这样的背景下，构建动物模型对于深入研究脓毒症有着至关重要的作用。首先，由于脓毒症患者在临床上病因复杂，常伴有其他严重的非相关疾病，并且接受着多种支持治疗，这些因素都会干扰对脓毒症自然病程的观察以及对其确切发病时间的判断，直接探讨人类脓毒症的病理生理机制相当困难。而动物模型可以免受上述这些因素的干扰，方便地采取脓毒症各个阶段的组织标本，比如肝、肺、肾等部位的标本，利于科研人员去深入探究脓毒症时体内炎症反应的发生、发展过程以及其他病理生理变化。
其次，临床脓毒症患者的遗传学背景非常复杂，加之年龄、性别、同时存在的其他疾病以及支持治疗等因素，会导致临床资料存在高度变异性。若要控制这种变异，就需要加大样本量，这无疑会耗费大量的时间，还会给临床脓毒症试验带来巨大的经济压力。而动物模型的生物学差异相较于人类要小很多，所以所需的样本量也明显少于临床观察，能够更高效地助力研究开展。
再者，在探索脓毒症发病机制时，常常要使用一些药物或试剂，像某种细胞因子的抗体或拮抗剂等，这些制剂可能具有毒性，或者还未经过临床的安全性检验，不能直接用于人体。但通过动物模型，就能方便地利用这些制剂来了解脓毒症发病的分子机制，并且还可对药物进行临床试验前的筛选，为后续开发有效的治疗方法提供参考依据。
总的来说，构建动物模型能够帮助科研人员更深入地研究脓毒症病理生理机制，进一步探究治疗方法，对于改善脓毒症患者的预后、降低死亡率以及攻克这一医学难题等方面，都有着不可或缺的重要意义。
二、大鼠脓毒症模型构建的基本要求
（一）模拟病理生理机制
脓毒症也称败血症，是一种严重的、全身性的感染性疾病，通常是由细菌等微生物侵入血液循环并在其中繁殖引起。其发病机制目前尚未完全明确，研究认为可能与机体的炎症反应、凝血、内皮功能、细胞凋亡、生化、免疫等病理生理过程故障相关，体内的内源性和外源性分子模式与相关模式识别受体相互作用发挥了关键作用。
从本质上讲，脓毒症是机体对感染性因素的反应，会经历不同阶段。在炎症方面，先是促炎爆发阶段，会有大量细胞因子释放，接着进入代偿性抗炎阶段，进而导致免疫抑制，当这两个阶段能相互平衡补偿时，患者存活率才会提高。而在血流动力学上，典型的脓毒症模型应该经历两个不同阶段，一是最初的高排低阻阶段，此阶段心输出量增加，外周血管阻力降低；随着脓毒症进展会逐步进入低排低阻阶段，特征表现为心输出量降低，外周血管阻力也降低。
动物模型要从本质上对这些病理生理机制进行模拟，才能符合研究需求。比如要能呈现出类似人体脓毒症时的炎症反应过程，以及对应的血流动力学变化特点等，这样科研人员才能基于模型去深入探究脓毒症的发生发展机制、药物干预效果等内容，真正为临床治疗脓毒症提供有价值的参考依据。
（二）具备关键要素
大鼠脓毒症模型必须具备以下几个关键要素：
首先，要有典型的血流动力学表现和高代谢状态，也就是要呈现出高排低阻的血流特点，心输出量、心率等指标会出现相应变化，同时机体代谢加快，消耗增加，如同在临床脓毒症患者身上观察到的机体代谢异常情况一样，以此来模拟真实的病理生理状态。
其次，要伴发多器官功能障碍。脓毒症常常会累及多个脏器，像肝脏可能出现大量空泡脂肪样变性，肝细胞肿胀并有炎性细胞浸润；肺组织会有毛细血管充血，肺间隔增厚，部分肺泡组织结构被破坏，炎症细胞浸润；肾脏可见肾皮质及间质水肿伴大量炎性细胞浸润，肾小管上皮细胞肿胀、空泡变性，坏死脱落等情况，在大鼠模型上也需要出现这些多器官功能受影响的表现，才能更好地契合临床实际。
再者，需要达到一定自然死亡率。根据脓毒症的转归，要求动物模型自然死亡率达到 50% - 70%。因为脓毒症本身是严重感染引起机体的炎症反应过度激活造成的自身损伤，不是细菌和内毒素对机体的直接损伤，所以出现器官功能障碍及动物死亡距脓毒症模型制备应有一定的时间间距，一般在制模后 6 - 12h 后发生的器官功能障碍或死亡属全身炎症反应所致，只有符合这样的死亡率要求，模型才更具研究价值。
（三）实验动物的选择
在构建脓毒症模型时，通常会选择雄性大鼠作为实验对象。这是因为雌性大鼠相较于雄性大鼠更能耐受脓毒症和失血性休克。尤其是进入发情期的雌性大鼠，其性激素水平变化很大，这会在一定程度上影响机体对脓毒症的反应以及相关生理指标的变化情况，不利于稳定地构建符合要求的脓毒症模型。
而雄性大鼠在脓毒症发生时，更易于出现免疫抑制等典型的病理生理变化，能够更好地呈现出脓毒症所具有的诸如炎症反应、血流动力学改变以及多器官功能障碍等各方面特征，从而使得构建出的模型更接近人类脓毒症的实际情况，更有助于科研人员去深入研究脓毒症的发病机制、探索有效的治疗方法等，所以雄性大鼠是比较适合用于构建脓毒症模型的实验动物选择。
三、常用的 CLP 造模法介绍
（一）CLP 造模法的原理
盲肠结扎穿孔（CLP）模型是目前模拟临床脓毒症最理想的动物模型之一，其原理主要基于两个关键阶段所引发的一系列病理生理变化。首先，在进行盲肠远端结扎操作后，结扎部位的组织会由于血液供应受阻等原因而发生变性坏死，这一局部的病理改变会迅速引发炎症反应，就如同机体在受到损伤时启动的自我防御机制一样，炎症因子开始聚集并发挥作用。
而后续的穿孔步骤则是引发全身性炎症反应的关键所在。盲肠内原本充满了各种各样的细菌，当对已经结扎的盲肠进行穿刺后，盲肠内的粪便内容物就会通过穿刺孔漏入腹膜腔，这些包含大量细菌的物质进入腹膜腔后，会导致多菌性细菌性腹膜炎。腹膜炎的出现使得细菌有了更多机会突破腹膜的防御屏障，进而发生细菌移位，进入血液循环，形成菌血症。随着细菌及其毒素在血液中不断扩散、作用，便会诱发全身性的炎症反应，使得机体的免疫系统、凝血系统、内皮功能等诸多生理功能出现紊乱，最终可能导致感染性休克、多器官功能障碍，甚至死亡，整个过程与人类脓毒症的发生、发展机制非常相似，所以 CLP 造模法被广泛应用于脓毒症相关的研究当中。
（二）CLP 造模法的操作步骤
CLP 造模法的具体操作流程需要严谨细致地执行，以下是详细的操作步骤：
大鼠麻醉消毒：首先要选择合适的麻醉方式对大鼠进行腹腔麻醉，确保大鼠处于合适的麻醉深度，避免在后续操作过程中因麻醉过浅而苏醒挣扎，或者麻醉过深影响其生命体征及实验结果。麻醉成功后，对大鼠的腹部手术区域进行常规的脱毛、消毒处理，一般常用碘酒及酒精依次擦拭，以尽可能减少手术部位的细菌感染风险，为后续的无菌操作创造良好条件。
腹部切口打开：选取腹部正中位置做切口，切口长度通常控制在约 2cm 左右，使用手术器械小心地逐层打开腹腔，过程中要注意避免损伤腹腔内的脏器组织，尽量保持手术视野清晰，减少不必要的出血等情况。
盲肠结扎位置确定：仔细寻找盲肠，然后小心地分离其远端与大肠的系膜，为结扎做好准备。在选择结扎位置时，较为常用的是在盲肠远端 1/2 处，使用无菌 4 号丝线紧紧地进行结扎。当然，也有一些研究根据不同的实验需求，会以盲肠供血动脉第二分支为终点界，远端为起点，按照轻度结扎 10%、中度 50%、重度 70% 等不同比例来确定结扎位置，但无论采用哪种方式，结扎的关键在于要确保结扎牢固，同时避免因结扎不当造成其他影响后续实验结果的情况，比如结扎后盲肠内压力异常等问题。
穿刺方式及操作：在已经结扎好的盲肠远端中央处，使用无菌的穿刺工具进行贯通穿刺，例如常用无菌 7 号针头或者 21G 针头（外径 0.8mm）等进行穿刺，穿刺时要尽量做到一次平稳穿透，避免多次穿刺造成的盲肠组织过度损伤。在穿刺后，可轻柔地挤压盲肠，使少量肠内容物从穿刺孔溢出，以确保穿孔通畅，模拟出类似临床脓毒症中肠道细菌进入腹腔的病理状态。
腹腔关闭：完成盲肠结扎和穿刺操作后，要小心地将盲肠推回腹腔，使其恢复到正常的解剖位置，然后按照外科手术的规范要求，逐层缝合关闭腹腔，注意缝合的力度和间距要适宜，保证腹腔的密封性，防止术后出现腹腔内容物外漏、感染等情况。
整个操作过程要求实验人员具备熟练的外科手术技能以及对脓毒症模型构建的深入理解，严格把控每一个环节，才能准确地构建出符合要求的 CLP 模型。
（三）影响 CLP 模型的因素
在构建 CLP 模型时，有多个因素会对模型的死亡率以及疾病严重程度产生影响，其中盲肠结扎位置和穿刺针直径是较为关键的两个因素。
就盲肠结扎位置而言，它对模型的影响十分显著。研究表明，不同的结扎位置所导致的术后大鼠死亡率以及脓毒症的严重程度有着明显差异。比如，当结扎 25% 或以下的盲肠时，死亡率几乎为零，这种情况下所模拟的属于轻度脓毒症；而结扎 50% - 60% 的盲肠，术后死亡率大约为 60%，对应的是中度脓毒症；要是结扎 75% 或以上的盲肠，小鼠往往会在术后 2 - 3 天内全部死亡，代表的则是重度脓毒症。并且在不同程度脓毒症中，死亡情况主要集中在最初的 48 小时内。还有相关实验通过改变盲肠结扎位置来调节脓毒症的严重程度，发现结扎长度超过 1cm 的小鼠相较于结扎长度小于 1cm 的小鼠，死亡率显著增加至 100%，由此可见结扎位置对模型结果影响之大。
穿刺针直径同样会影响 CLP 模型的相关指标。有研究通过改变穿刺针的直径进行对比实验，结果显示，增加穿刺针的直径会使得大鼠的存活率明显降低，例如使用 22G 针时存活率可以达到 100%，但更换为 19G 针后，存活率就降低至 55% 了。不过，在对比盲肠结扎位置和穿刺针直径这两个因素对模型影响的程度时，多数研究认为盲肠结扎位置比针头大小的影响更为突出。
此外，除了这两个主要因素外，像是否使用抗生素以及 CLP 术后的支持治疗等情况，也会在一定程度上对模型中脓毒症的严重程度、大鼠的存活情况等产生影响，所以在制作 CLP 模型时，必须全面、仔细地考虑所有可能影响实验的条件和技术参数，只有这样才能获得可重复且稳定一致的实验结果，为后续的科研工作提供可靠的动物模型基础。
四、大鼠脓毒症模型的评价
（一）临床表现观察
在构建大鼠脓毒症模型后，对脓毒症组大鼠与正常组大鼠进行对比观察，可以发现诸多不同的临床表现。脓毒症组大鼠术后往往苏醒延迟，待其苏醒后，精神状态萎靡不振，身体常常蜷缩起来，基本不怎么活动，与正常组大鼠的活跃状态形成鲜明对比。而且其进食进水的量明显减少，对外界的各种刺激反应也较为迟钝，不再像正常组大鼠那样对外界充满好奇和反应灵敏。呼吸频率方面，脓毒症组大鼠会出现加快的情况，被毛变得蓬松且缺乏光泽，大便稀软，不再像正常状态下那样扎堆取暖。
随着时间的推移，在术后 12h 左右就可能会出现死亡的大鼠，大部分存活下来的大鼠后续会逐渐出现皮温降低、肌力减弱的现象，眼周还会有血性分泌物出现，彻底停止进食进水，排泄的粪便呈稀水样，颜色发黄且伴有腥臭味。进一步发展下去，大鼠会呼吸急促，当被人为摆成被动仰卧的姿势时也毫无反抗之力，排泄物转变为黏液状，量也增多，最终走向死亡。对死亡大鼠进行剖腹检查时，可看到有恶臭味的血性渗液，肠管呈现水肿黏连的状态，盲肠也发生坏死变黑，这些表现都体现出脓毒症对大鼠机体造成的严重影响。
（二）组织病理学改变
1. 心脏组织
通过光镜观察对比对照组与模型组大鼠的心脏组织，可以发现明显的差异。对照组大鼠的心肌肌纤维结构排列紧密有序，不存在水肿、充血以及渗出等病理现象。而模型组大鼠的心肌肌纤维结构则排列疏松，出现了带状空泡化的情况，细胞核呈现肿胀状态，间质也伴有水肿、充血等病理改变，这些变化表明脓毒症已经对大鼠的心脏组织产生了实质性的损害，影响了心脏正常的结构与功能。
2. 肝脏组织
模型组大鼠的肝脏组织在病理上出现了较为典型的变化，表现出大量空泡脂肪样变性，肝细胞发生肿胀，并且有炎性细胞浸润其中。这种空泡脂肪样变性会干扰肝脏正常的代谢等功能，炎性细胞浸润则意味着肝脏组织发生了炎症反应，整体说明脓毒症引发了肝脏的病理改变，使其处于非正常的病理状态。
3. 肺组织
模型组大鼠的肺组织也受到了脓毒症的显著影响，肺间隔出现增厚的现象，部分肺泡组织结构被破坏，不再完整，同时伴有炎症细胞浸润。肺间隔增厚以及肺泡结构破坏都会影响肺部正常的气体交换等功能，炎症细胞浸润则进一步加重了肺部的病理状态，使得肺部的正常生理功能难以维持，整体肺部的健康状况因脓毒症而变差。
4. 肾组织
在肾组织方面，模型组大鼠的肾皮质及间质出现水肿情况，并且伴有大量炎性细胞浸润。肾小管上皮细胞也有明显的病理改变，表现为肿胀、空泡变性，甚至发生坏死脱落，肾小管囊腔出现扩张、管型形成等现象，皮髓质境界也变得欠清晰，肾小球出现收缩、毛细血管微血栓形成等问题。这些多部位、多种类的病理改变说明脓毒症严重影响了大鼠肾脏的正常结构与功能，使其出现了功能障碍的风险。
5. 小肠组织
模型组大鼠的小肠组织同样发生了一系列病理现象，小肠粘膜出现水肿，有白细胞浸润其中，还存在出血以及上皮细胞坏死脱落的情况。小肠粘膜作为消化吸收等功能的重要部位，这些病理改变必然会影响其正常的生理功能，干扰营养物质的吸收等过程，进一步体现了脓毒症对大鼠消化系统造成的危害。
（三）标志因子水平变化
血浆中部分细胞因子水平的变化是脓毒症的典型特征之一，在脓毒症模型构建后，像 IL－1β、TNF－α 及 IL－6 等主要的促炎症细胞因子会出现显著升高的情况。这些细胞因子在正常状态下维持在一定水平，参与机体正常的免疫调节等生理过程，但在脓毒症发生时，由于机体的炎症反应被过度激活，它们的分泌量大量增加。其水平的升高能够反映出机体炎症反应的强度，也可以作为评价脓毒症模型是否成功构建以及疾病严重程度的重要指标，对于后续研究脓毒症的发病机制、药物干预效果等方面都有着重要的参考价值，帮助科研人员更好地了解脓毒症状态下机体内部的病理生理变化情况。
五、构建大鼠脓毒症模型的注意事项
在构建大鼠脓毒症模型的过程中，有诸多方面的注意事项需要着重关注，以下为大家详细介绍：
操作人员的技术熟练度
构建大鼠脓毒症模型，尤其是采用如盲肠结扎穿孔（CLP）这类手术操作要求较高的造模方法时，操作人员必须具备熟练的外科手术技能。例如，在进行腹腔麻醉时，要准确把握麻醉药物的剂量以及注射的深度和角度等，像按照合适的体重比例抽取如 1.5% 戊巴比妥钠（40mg/kg）进行腹腔注射，先将动物固定，腹部用酒精棉球擦拭消毒，然后在左或右侧腹部将针头刺入皮下，沿皮下向前推进约 0.5 厘米，再使针头与皮肤呈 45 度角方向穿过腹肌刺入腹腔，同时通过止血钳夹小鼠脚趾等方式确定麻醉深度，避免麻醉过浅导致大鼠在手术中苏醒挣扎，影响操作甚至造成伤害，或者麻醉过深影响其生命体征及后续实验结果。
在腹部切口打开环节，选取腹部正中位置做切口，长度控制在约 2cm 左右，使用手术器械小心逐层打开腹腔时，要做到手法精准、稳定，防止损伤腹腔内的脏器组织，时刻保持手术视野清晰，尽可能减少不必要的出血情况。还有盲肠结扎和穿刺操作，结扎时要确保牢固程度适中，像在盲肠远端 1/2 处（或依据不同实验需求按相应比例确定结扎位置）用无菌 4 号丝线紧紧结扎，避免因结扎不当造成盲肠内压力异常等问题；穿刺时要选用合适的无菌穿刺工具（如无菌 7 号针头或者 21G 针头），尽量一次平稳穿透，避免多次穿刺致使盲肠组织过度损伤，且穿刺后轻柔挤压盲肠使少量肠内容物溢出保证穿孔通畅，这些步骤都极为考验操作人员的手上功夫与熟练度，任何一个环节操作不当，都可能影响模型构建的准确性和稳定性。
实验条件和技术参数的把控
手术环境及器械消毒：手术环境要保持无菌状态，手术器械必须严格进行消毒处理。因为脓毒症本身就是感染引发的严重疾病，若手术环境或器械存在细菌等微生物污染，很可能干扰实验结果，导致构建的模型不符合预期，或者使大鼠因额外的感染因素影响而出现异常情况，无法真实反映脓毒症的发生发展过程。例如，手术刀、镊子、止血钳等器械在使用前通常需要经过高温高压灭菌或者浸泡在合适的消毒液（如 75% 酒精、碘伏等）中充分消毒，确保无菌操作条件，降低造模过程中的干扰因素。
模型影响因素的控制：在 CLP 造模法中，盲肠结扎位置和穿刺针直径等因素对模型的死亡率以及疾病严重程度有着关键影响。不同的盲肠结扎位置会导致术后大鼠死亡率以及脓毒症的严重程度出现明显差异，比如结扎 25% 或以下的盲肠时，死亡率几乎为零，模拟的是轻度脓毒症；结扎 50% - 60% 的盲肠，术后死亡率大约为 60%，对应的是中度脓毒症；结扎 75% 或以上的盲肠，小鼠往往会在术后 2 - 3 天内全部死亡，代表的则是重度脓毒症。所以在实验设计时，要根据研究目的精准选择结扎位置。同样，穿刺针直径改变也会影响大鼠的存活率等指标，如使用 22G 针时存活率可以达到 100%，更换为 19G 针后，存活率就降低至 55% 了。此外，像是否使用抗生素以及 CLP 术后的支持治疗等情况，也会在一定程度上对模型中脓毒症的严重程度、大鼠的存活情况等产生影响，因此需要全面、仔细地考虑并控制好所有可能影响实验的条件和技术参数，才能获得可重复且稳定一致的实验结果。
动物饲养及后续观察
动物的选择与饲养管理：选择合适体重和健康状况的大鼠很关键，通常会选用成熟期雄性 Sprague-Dawley 大鼠，体重在 400 - 500g 左右，并且在购买回来后要进行适应性饲养 1 周，保证其自由饮水、饮食，使其适应实验环境，减少应激反应对实验的干扰。术前还需禁食 12 小时，以符合手术要求，降低手术风险。饲养环境要保持温度、湿度适宜，饮食清洁卫生，避免大鼠因环境不佳或饮食问题出现健康异常，影响模型构建效果。
术后观察与护理：手术后对大鼠的观察和护理不容忽视。要密切留意大鼠的苏醒情况、精神状态、饮食进水情况、呼吸频率、体温以及排泄物等临床表现。比如脓毒症组大鼠术后往往苏醒延迟，苏醒后精神萎靡、蜷缩少动、进食进水减少、对外界刺激反应迟钝等，若发现异常表现要及时记录并分析判断是否符合脓毒症模型的特征。同时，要注意给大鼠做好保温措施，必要时进行补液（如皮下注射预热的生理盐水等），减少其死亡率。另外，在合适的时间点按照实验计划进行采血、取尿等操作，以检测如细胞因子水平、肌酐值等各项指标的变化，全面评价脓毒症模型是否成功构建以及疾病的进展情况。
总之，只有在操作人员技术熟练、严格把控各项实验条件和技术参数，并且做好动物饲养及后续观察等多方面工作的基础上，才能保障大鼠脓毒症模型构建的。
