细胞凋亡检测

应用简介

细胞凋亡是细胞主动实施的一种程序性死亡，是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面起着十分重要的作用。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。

技术原理

AnnexinⅤ是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的PS高亲和力特异性结合。因此AnnexinV作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将AnnexinⅤ进行荧光素FITC标记，以标记了的AnnexinV作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙锭（PropidiumIodide,PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜使细胞核染红。因此将AnnexinV与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

基本特征：

细胞凋亡具有特定形态学和生物化学特征：

1、形态学特征：凋亡常发生于单个细胞，其形态变化分3个阶段：第一阶段可见凋亡细胞与相邻细胞分离，细胞皱缩，染色质浓缩，聚集于核膜周围呈半月形，亦可发生核断裂，核仁裂解。第二阶段可见细胞表面突出，分成多个膜包绕小体，含有部分核和／或完整的细胞器，称为凋亡小体（apoptosisbodies）。第三阶段，凋亡小体被组织细胞或吞噬细胞吞噬降解。在有内皮的腔中如胆管、凋亡小体可以排入腔内；在组织培养中，凋亡细胞与邻近细胞和培养基质相分离。整个凋亡过程在几小时内全部完成。与坏死相比，凋亡的显著特点是整个过程中浆膜保持完整，减少了细胞成分外漏，因此，没有或仅有很轻炎症反应。而坏死是病理因素作用使细胞膜失去完整性而引起细胞溶解，通常波及相邻细胞，表现为细胞肿胀，细胞器溶解，细胞膜破裂，伴有组织炎症。由于凋亡过程迅速，凋亡小体较小，因此，在光镜下不易发现细胞凋亡。

2、生物化学特征：细胞凋亡的生物化学特征是DNA断裂，这种断裂不是随机的，它与细胞内核酸内切酶的激活有关。在内切酶作用下，细胞核中的DNA裂解成核小体大小的片段，每个核苷酸片段大约有180～200个碱基对。在琼脂糖凝胶电泳上出现典型的阶梯样的DNA区带。而坏死的细胞，DNA被溶酶体释放的多种水解酶随机降解，DNA电泳呈模糊、微弱的踪迹，不能形成阶梯状，以此可区别细胞凋亡和坏死。但是核小体断裂是凋亡的晚期表现，并不普遍存在。

实验方法

注意事项

1、诱导培养细胞时间要准确。

2、AnnexinV是光敏物质，在操作时要注意避光。

3、细胞凋亡是一个动态的过程，反应一小时后荧光强度就开始衰变，荧光显微镜下观察细胞时，由于荧光易碎灭，观察时要尽量快。

4、整个操作过程动作要尽量轻柔，切勿用力吹打细胞，尽量在4℃下操作。