co-ip检测

应用简介

Co-IP主要用于检测蛋白质与蛋白质之间相互作用，是IP实验的一种扩展，基于IP反应的潜力，在样品溶液中捕获和纯化主要目标（抗原等）及通过天然相互作用与靶标结合的其他的大分子。此外，还可以利用Co-IP来确定在不同条件下的蛋白质相互作用。

技术原理

免疫共沉淀是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的ProteinG或A能特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段的方法。其基本原理是在细胞裂解液中加入感兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于磁珠的ProteinG或A，若细胞中存在与兴趣蛋白相结合的目的蛋白，就可以形成蛋白复合物：“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—ProteinG或A”；最后通过免疫印迹实验来检测目的蛋白。

实验方法

技术总结

1、实验样品制备方法准备：很重要！根据研究目的，检测样品可能是组织样品，也可能是细胞样品，不同样品制备流程不太相同，目的蛋白表达量也有较大差别，必须选择合适的样品和样品制备方法；

2、根据研究目的选择适合的蛋白特异性抗体：非常重要！用于Co-IP实验的抗体是针对目的蛋白的特异性抗体，最理想的是选择一种能识别兴趣蛋白质某个表位的抗体，且这个表位不会被任何其他蛋白质相互作用所掩盖，比普通WB抗体要求高出很多；同时，抗体特异性和灵敏性尽可能高，才有可能有干净的背景和较好的IP效果，所以必须选择最适合的抗体用于Co-IP实验；

3、细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP-40或Triton-X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定；

4、不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂；

5、使用对照抗体：单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗;兔多克隆抗体：正常兔IgG；

6、确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；

7、要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀；

8、确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。