CRISPRCas9技术

应用简介

简单来讲，CRISPR/Cas9是一种分子生物学技术，通过这种技术科研人员可以对细胞和生物体内的基因进行编辑。所谓的基因编辑就是通过某种生物手段和技术，对生物体内的遗传物质进行修改。基于原核生物的获得性免疫系统研发出的CRISPR/Cas9技术只包含两种重要的成分，一种是行使DNA双链切割功能的Cas9蛋白，而另一种则是具有导向功能的sgRNA（single guide RNA）。当细胞内同时表达sgRNA和Cas9蛋白时，Cas9蛋白通过与sgRNA结合，靶向到目的DNA序列上发挥DNA双链切割的功能。DNA序列被切割产生断裂后，引发细胞内部的DNA修复机制（DNA repair）。真核细胞同时存在着同源重组修复和非同源重组修复。在同源重组修复下，断裂的染色体以另一条完整的姐妹染色单体为模板进行DNA修复，而在非同源重组修复下，断裂出的DNA随机修复，引入新的碱基，使基因产生移码突变。

技术原理

CRISPR/Cas9系统的工作原理是crRNA (CRISPR-derived RNA) 通过碱基配对与 tracrRNA (trans-activating RNA) 结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点处剪切双链 DNA，从而实现对基因组DNA序列进行编辑；而通过人工设计这两种 RNA，可以改造形成具有引导作用的gRNA (guide RNA)，用以引导 Cas9 对 DNA 的定点切割。

靶位点的选择要求：

1、靶位点主要包括20 个碱基，并且这20个碱基后面是NGG的PAM 区；

2、靶位点尽量选择在基因编码区的前端；

3、转化应选择对应抗性的LB平板培养基。

实验方法

技术总结

Crispr/Cas9慢病毒特点： 

1、适用于在同一个细胞系中需要进行多个基因敲除的实验；

2、基因敲除效率比直接质粒转染更高；

3、提供多种不同荧光和抗性标记的慢病毒表达载体，更易筛选到基因敲除成功细胞；

4、接受cas9蛋白稳定表达不同细胞系定制。

Crispr/Cas9腺病毒特点：

1、可感染多种分裂期和非分裂期细胞，感染效率高、敲除效率高；

2、操作简单，容易掌握；

3、基因敲除周期短，成本低；

4、适合哺乳动物不同种属不同基因的操作，适用范围广。