荧光定量PCR

应用简介

荧光定量PCR是检测生物样品中RNA含量的最普遍的方法，通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。目前主要使用Sybrgreen和taqman法对RNA含量进行检测。

技术原理

1、SYBRGREENI是一种只与DNA双链结合的荧光染料。当它与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。SYBRGreen荧光染料定量PCR的基本过程是：1、开始反应，当SYBRGreen染料与DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性时，SYBRGreen染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成后，SYBRGreen染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。

2、TaqMan探针法核心是探针分子，TaqMan探针是单链DNA，5’端偶联发光基团，3’端偶联淬灭基团，游离的完整探针是检测不到荧光信号的，发光基团发出的荧光会被淬灭基团吸收淬灭，探针被水解，发光基团和淬灭基团远离就可以检测到荧光信号。反应开始时，模板链经热变性解链形成单链，TaqMan探针优先跟模板链退火，引物随后退火到模板上，之后进行链的延伸，延伸过程中Taq酶发挥5’-3’外切酶活性，遇到探针会从5’端逐个碱基切除探针，发光基团会跟淬灭基团分开，因此荧光检测系统可以接收到荧光信号，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，荧光信号的累积和PCR产物形成是同步的。

TaqMan探针法的特异性除了由引物提供，更由探针分子保证，因其退火温度更高，所以TaqMan探针法特异性更好，在一个反应体系中加入多条探针，可以做多个基因同时检测。

实验方法

TaqMan探针法

技术总结

一、引物设计

1、序列选取应在基因的保守区段；

2、Taqman探针技术要求片段长度在50bp-150bp；

3、避免引物自身形成环状发卡结构。避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对；

4、典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性，较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。Tm值在55-65℃，GC含量在40%-60%；

5、引物之间的Tm值相差避免超过2°C；

6、引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基；

7、为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子；

8、探针位置尽可能地靠近上游引物；

9、探针的5'端应避免使用碱基G，引物的3’端避免使用碱基A。探针长度通常在25~35bp，Tm值在65~70°C,通常比引物Tm高5~10°C，GC含量在40%~70%；

10、整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量；

11、为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在Blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。

二、热启动

热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。 

三、镁离子浓度

镁离子影响PCR的多个方面，如：对DNA聚合酶的活性的影响进而影响产量;对引物退火的影响，进而影响特异性。若dNTP和模板同镁离子结合，则降低了酶活性所需要的游离镇离子的量。

四、模板质量

模板的质量会影响产量。DNA样品中可能有多种污染物会抑制PCR。

五、防止残余污染

1、PCR易受污染的影响，因为它是一种敏感的扩增技术。小量的外源DNA污染可以与目的模板一块被扩增。当前一次扩增产物用来进行新的扩增反应时，会发生共同来源的污染。这称之为残余污染。从其它样品中纯化的DNA或克隆的DNA也会是污染源(非残余污染)。

2、可以在PCR过程中使用良好的实验步骤减少残余污染。为PCR样品配制和扩增后分析设计隔离的区域，在准备新反应前更换手套。总是使用不含有模板的阴性对照检测污染。使用预先混合的反应成份，而不是每个反应的每个试剂单独加入。