脑缺血模型

应用简介

MCAO是middle cerebral artery occlusion 的缩写形式，中文意思为中脑动脉栓塞。大脑中动脉栓塞模型并不是把线栓插进大脑中动脉，而是经颈内动脉入颅并插入大脑前动脉，从而阻塞来自栓塞侧的大脑前动脉的血供，以及堵塞接受后交通动脉血供的的颈内动脉颅内段。

缺血性脑损伤常见于中老年人，具有发病率、死亡率、致残率、复发率高的特点，是目前重点防治的一种疾病。大脑中动脉(MCA)为临床上发生脑缺血损伤最常见的部位之一。故大脑中动脉阻塞(MCAO)模型被广泛用于局灶性脑缺血的研究。用血管内线栓阻断法制备大鼠MCAO模型，已被脑血管病研究者广泛接受和采用。目前实验室较多采用MCA阻断0min、90min和120min的短暂脑缺血-再灌注模型。

脑缺血模型

脑缺血模型主要通过实验动物（大鼠）来模拟人的脑部血管血流减少以及阻断的过程，以便为脑缺血的预防和治疗提供科学依据。匹配医学研究方向：脑外科、神经内科等。

实验方法：

动物分组选用健康SD雄性大鼠,体质量250至300g,所有大鼠被随机分为正常组、假手术组、模型组3组,每组9只。大鼠腹腔麻醉后固定,分离右颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)及颈(ECA)并挂线备用。结扎CCA与ECA,用动ICA远心端后,迅速在ECA与ICA分叉处作,切口处插入一端加热成光滑球形尼龙线。线ICA后,于入口处稍微结扎尼龙线与入口处ICAICA的动脉夹,继续插入尼龙线至稍有阻力后略回撤,至线插入深度为(18.5- 0.5)mm左右,实现大脑中动脉阻塞导致脑缺血,再次结扎入口处,尼龙线外留约1cm,缝合皮肤,2h后轻提所留线头至有阻力,实现大脑中动脉再灌注。此模型操作较为简单,缺血灶明确,可重复性强,同时模型评价：动物醒后约1h，即出现神经功能缺损情况，并借此判定手术成功性。TTC染色可检测手术成功的动物出现脑梗死灶。常规组织切片染色可见脑缺血区神经元、胶质细胞、血管及神经毡等损伤，以及星形胶质细胞增生、活化，炎细胞浸润等病理变化。

实验过程：

1、SD大鼠称重，7%水合氯醛（0.5ml/100g）麻醉。将大鼠用医用胶带固定于操作台上，颈部剃毛。

2、颈部酒精棉球消毒，眼科剪沿锁骨正中做竖向切口，长度约3~4cm左右。

3、分离皮下肌肉组织，可见底部肌肉下方有轻微搏动即为颈总动脉，钝性分离覆盖于颈总动脉上方的肌肉，当分离出颈总动脉后，眼科镊小心分离伴行于颈总动脉的迷走神经，继续小心分离干净动脉周围粘膜组织，分离出的颈总动脉大约1~1.5cm左右即可。

4、小心剔除覆盖于动脉上方的粘膜组织，此时可见颈外动脉、颈内动脉与颈总动脉呈“Y字形”分布，分离出独立的两根动脉（颈外、颈内）。血管分离完毕后，结扎颈总动脉（越靠尾部越好）。

5、再结扎颈外动脉，两个结扎之间备线，打松结。动脉夹暂时夹闭颈内动脉。在备线与颈总动脉结扎处之间，用眼科剪做一“V字形”切口，在离Y字形分叉处约0.8 mm处位于血管的正前部剪一“V”形切口，使血管在自然状态下，用眼科镊夹持栓线，缓慢进入颈内动脉，到达动脉夹时，将预留的线稍微拉紧（防止远心端回流渗血），松开动脉夹，将颈总动脉稍向右拉继续插入栓线，当特制栓线黑色标记处到达Y字形分叉口附近时，此时栓线已进入大脑中动脉且不能继续前行。

6、栓线插入完毕后，将预留的结扎线拉紧固定。医用小棉签清理颈部血块，逐层缝合皮肤，酒精棉球消毒，将大鼠放回笼子。1.5 h过后，麻醉大鼠，颈部消毒，打开一个小口，用眼科镊夹住栓线固定处将栓线拔出至其头端，剪去多余栓线，逐层缝合，消毒；假手术组仅剥离颈总动脉后立即缝合创口。术后放回笼子，给予充足饲料和水。

观察指标：

MCAO动物研究中，可根据动物的生理病理特点，从运动、感觉、意识、神经反射等方面检测动物的神经功能损伤和恢复程度。神经功能学评价不仅是判断模型成功与否的指标，也为观测病理生理发生发展的进程、模型规范化及药物干预的研究提供了一定的依据。

Zea Longa法为5级0～4分制：0分，无神经损伤；1分，提尾时对侧前肢内收屈曲(轻度神经损伤)；2分，爬行时向对侧旋转(中度神经损伤)；3分，站立或爬行时，向对侧倾倒(重度神经损伤)；4分，无自主活动伴意识障碍。

通常MCAO再灌注动物模型制作成功后，死亡主要发生在2d内，而再灌注3d后，动物的死亡率则大大降低。此外，大部分3分者及所有4分者多在24h内死亡，2d内的死亡率几乎是100％，主要原因是手术造成蛛网膜下腔出血和(或)脑水肿，因此所有不同再灌注时间点内的动物，取材时需摒弃蛛网膜下腔出血者。客观地讲，缺血1h的MCAO再灌注动物模型的“有效”成功率通常在60％左右，而缺血超过1h的MCAO再灌注动物模型“有效”成功率则更低。因此，在MCAO再灌注动物模型中，最有价值的应该是Zea Longa评分1～2分者。此外，有部分Zea Loga评分1分者的神经缺损症状  可在1d内消失，取材后证实梗死灶多数在纹状体区，而皮质区无梗死。

需要强调的是，术后部分大鼠出现缺血侧瞳孔缩小、眼裂变小等症状，即Horner征，由手术中损伤颈部交感神经，引起瞳孔开大肌与睑板平滑肌(Müler肌)麻痹所致，与脑缺血无关，因此不可将其视为手术成功的指标之一。在评分时，需注意1分为Zea Longa评分所有2～4分的基础分。也就是无1分的基础分。2～4分的评分应视为无效。

改良的Garcia JH评分方法从大鼠自主运动、体态对称性、前肢伸展功能、攀爬运动、身体双侧触觉、双侧胡须碰触反应等6个方面评估大鼠神经功能损伤的程度。分值为3～18分，数值越大，神经功能损伤越轻，18分为正常。模型动物存在明显的学习记忆障碍,是目前较理想的VD模型。 

技术总结

1、整个实验很费动物，存在15-30％的淘汰率；

2、大鼠大脑中动脉永久性闭塞性脑缺血模型，梗死体积出现的最小时间点可能为2h，体积随时间进行性增大，至12h基本趋于稳定；

3、在颈内和颈外之间常常会有一个交通支，其位置也不太相同。