Tunel染色

Tunel染色

Tunel染色即原位末端转移酶标记技术。凋亡细胞的DNA双链断裂或一条链出现缺口，产生一系列3’-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)作用下，将脱氧核糖核苷酸和生物素所形成的衍生物标记到DNA的3′末端，从而进行凋亡细胞的检测。TUNLE染色是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征。

技术原理

晚期凋亡细胞中染色体DNA双链或单链断裂产生粘性3'-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的催化下，将带有生物素(Biotin)分子的dUTP，标记到DNA的3'-末端，随后和辣根过氧化物酶(HRP)标记的链酶亲和素Streptavidin(Streptavidin-HRP)结合，最后通过DAB显色来显示凋亡细胞，从而可以通过普通光学显微镜检测到凋亡的细胞，这就是Tunel(TdT-mediateddUTPNick-EndLabeling)法检测细胞凋亡的原理。

实验流程

关键实验步骤

1.充分脱蜡和水化。脱蜡可以先60oC 20min，再用使用二甲苯两次5-10min；而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀；

2.把握好细胞通透的时间。一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k的孵育时间，常用10-30min，几μm切片用短时间；几十μm切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和抗体进入胞内。

3.适当延长TUNEL反应液的时间。一般是37oC1h，你也可以根据你的凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至2h，但要结合你最终的背景着色。

4.DAB显色条件的选择。一般DAB反应10min左右，结合镜下控制背景颜色，最长不超过30min；promega公司提供的DAB液（桃红色），不利于辨认棕褐色，我不太喜欢。

5.PBS的充分清洗。在TUNEL反应后和酶标反应后的清洗应十分严格，可增加次数达5次，因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。

6.内源性POD的封闭也十分关键。对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，我的经验是适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度，可以达到很好的封闭效果，且不影响最终的特异性染色。

实验结果展示：

注意事项

1、洗涤蛋白酶K时，一定要PBS冲洗3次，如果冲洗不净会严重干扰后续的标记反应；

2、3%的过氧化氢溶液孵育时间不应过长，否则会出现过氧化氢导致的DNA断裂，产生假阳性；

3、滴加Tunel检测液时，可利用防蒸发膜防止其蒸发影响样本的生物素标记；配制好的DAB显色液必须一次性使用完毕，不宜冻存。

常见问题

无/弱染色？

烤片温度过高，推荐56℃-60℃1-2h；

一抗是否适用固定液和石蜡切片，使用浓度是否过低，孵育是否时间过短等。

染色过深？

染色试浓度过高或孵育时间过长；

显色剂浓度过高或孵育时间过长。

送样运输要求：

      1、石蜡切片常温、组织由标准的石蜡包埋盒包埋，石蜡与组织要均匀接合，不能有裂痕；蜡块厚度根据所需切片的数量而定，有效厚度至少要超过0.1cm。尽量提供半年内的组织蜡块，超过半年的蜡块抗原可能丢失，做免疫组化可能出现检测不到蛋白。

      2、冰冻切片-20℃、固定后细胞爬片4℃。